【求助】为何“总蛋白定量一致，Actin条带显示不均一”

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-7-03 16:18 作者: luoliqiong 来源: 分析测试百科网

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【求助】为何“总蛋白定量一致，Actin条带显示不均一”

各位战友及WB高手:
我初做WB，最近有个问题已经困扰我好久了，特向各位有经验的战友请教！我使用不同毒物处理体外培养的细胞，然后提取细胞总蛋白行某凋亡蛋白检测。上样前使用BCA法对不同处理组提取蛋白进行浓度测定并据此平衡各孔上样量，结果连续好几次显色都出现这样相同结果：其中某几个特定处理组（对细胞生长的影响较明显）的Actin条带总是较其它处理组谈，而剩余几组的Actin条带则非常均一。故现向各位战友求教，产生这种现象的内在机制是什么？我应该如何调整我的实验？通过总蛋白定量来平衡各孔的上样量在什么情况下才会和内参蛋白的表达呈线性的一致？谢谢啦！

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最新回复

kuaizige (2013-7-03 16:18:51)

关注这个问题,期待高手解答.
我同样也遇到这个问题。不只是WB，在RT-PCR时总RNA上样量一样，最后PCR产物内参GAPDH条带也不一样。

不过这两个只是相对定量，结果都是要用目的带与内参的光密度比值，所以尽管内参条带不一样，也不影响结果分析，我看了一些外文也有内参条带粗细不一的。我觉得只是图不漂亮而已。是不是？

期待中……
duoduo (2013-7-03 16:19:10)

顶哦！我也遇到这个问题，而且用BCA定量后内参条带差异很大，不知怎么解释！请高手们赐教一二啊！
idea2011 (2013-7-03 16:19:33)

GAPDH、beta-actin等常用作蛋白或RNA表达的内参，但是并不表示它们就一定没会有表达改变的。如果蛋白定量没有问题，换个内参试一下，有可能你选的“内参”在你的实验条件下本来就是有表达改变的。
另外，检查一下样本制备过程，不同组之间或者是不同样本之间是不是存在不一致，这也可能导致内参量不同。
luoliqiong (2013-7-03 16:21:02)

QUOTE:
原帖由 idea2011 于 2013-7-3 16:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

GAPDH、beta-actin等常用作蛋白或RNA表达的内参，但是并不表示它们就一定没会有表达改变的。如果蛋白定量没有问题，换个内参试一下，有可能你选的“内参”在你的实验条件下本来就是有表达改变的。
另外，检查一下样本制备过 ...
（1）能否请您具体解释一下在什么情况下“GAPDH、beta-actin的表达也会发生明显改变”？如果变换“内参”，有什么可参考的原则或规律？您是否也曾因遇到过这样的问题，通过变更内参后解决？
（2）就是因为在反复多次实验中总是某几个特定的处理组出现内参不一致的情况，而且同时做的其它处理组的内参则非常均一，所以才心生困惑。
idea2011 (2013-7-03 16:21:38)

QUOTE:
原帖由 luoliqiong 于 2013-7-3 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

（1）能否请您具体解释一下在什么情况下“GAPDH、beta-actin的表达也会发生明显改变”？如果变换“内参”，有什么可参考的原则或规律？您是否也曾因遇到过这样的问题，通过变更内参后解决？
（2）就是因为在反复多次实验中总是某几个 ...
1。这种情况我倒没见过，但是我做基因和蛋白表达的时候一般会注意看选用的内参是不是表达一致

2。内参表达发生改变的情况：就以你用的GAPDH为例，表达改变可以参见文章：
1) mRNA表达改变
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17123754?ordinalpos=5&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum')
2) 蛋白表达改变
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16469296?ordinalpos=8&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum')
3) 看这篇文章的题目：The Housekeeping Genes GAPDH and Cyclophilin Are Regulated by Metabolic State in the Liver of Dairy Cows cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14672171?ordinalpos=16&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum')

3。选用内参的原则，个人觉得有以下几点
1) 是管家基因(housekeeping gene)
2) 在检测的组织中有稳定表达
3) 内参和目的蛋白的分子量相差较大便于区分
4) 根据蛋白样本制备方法选取，比如说有时需要选用膜蛋白或核蛋白
5) 根据组织特异性选取，比如说肌肉组织中beta-actin分布较少
6) 参考相关文献选取同类实验常用的内参
阿敏 (2013-7-03 16:22:37)

我也出现这种情况呢！而且相差得很明显，如何解决呢？
qumm1985 (2013-7-03 16:22:55)

唉，本人也正碰到这种问题。
我用的A549，BEAS两种细胞株做得，A549中actin条带就明显比BEAS的粗
zzzz (2013-7-03 16:23:17)

我也是，做了三个多月的WB，一直都是actin不均一的缘故，重做，可是即使我蛋白定量没问题后，仍然不行，很纠结啊
ROSE李 (2013-7-03 16:23:35)

本身蛋白定量就有误差，再者，不同的实验也应该选取不同的内参，根据自己实验需要选择，蛋白定量之前样品都要稀释之后再定量，测浓度肯定是要稀释的，具体倍数就要看平时经验，一般5-10倍稀释，一般内参也不可能达到完全一样，经过软件分析得出的灰度值基本一致就可以了。如果内参相差很大的话，就要考虑自己的操作问题，同时也要考虑到内参选择，