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【求助】pet-28a，蛋白表达不出来

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-7-05 11:02    作者: 小游abc    来源: 分析测试百科网

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【求助】pet-28a，蛋白表达不出来
小弟最近几个月一直在做原核表达，本打算表达三个蛋白，可就是一个目的蛋白条带都没有出现。相当的郁闷啊。希望各位提一些建议.........
首先从ncbi下载三个基因的cds（从ATG开头到终止密码子）。然后选用新买的pET28a作为载体，设计引物，pcr扩增，跑胶验证都正确。pcr产物纯化（kit），酶切（目的片段、载体），酶切纯化（kit），T4连接酶 16度过夜，取10μL连接产物转DH5a感受态（克隆菌）。接着，挑10个菌落做菌落pcr，进行初步验证，再选择菌落pcr阳性的管，摇菌过夜，提质粒双酶切验证（成功），送公司测序也正确。
测序正确重组质粒再转入表达菌BL21（DE3），挑菌做菌落pcr，菌落pcr阳性的再摇过夜，提质粒双酶切验证（成功），取双酶切验证正确的菌摇过夜，取1ml接种到100mlLB中，od0.4-0.6时添加IPTG，分别取2 4 6 8时段1ml保存。
可是，跑sds-page的时候就是没表达。诱导前后没有特异条带，三个基因都是这样。呕血啊。大大们，帮帮我撒。

后面我又借用别人的PET32a，也进行了上面的实验，结果诱导前后只用表达标签蛋白（20kDa左右），目的蛋白是33kDa左右。
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最新回复

  • bs4665 (2013-7-05 11:08:52)


    你没切信号肽。

  • 小游abc (2013-7-05 11:09:52)

    QUOTE:

    原帖由 bs4665 于 2013-7-5 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    你没切信号肽。
    怎么切信号肽呢？

  • bs4665 (2013-7-05 11:10:18)


    用信号肽分析软件，预测出你的三段序列各自的信号肽是多少个氨基酸，然后换算成多少个核苷酸（bp），然后设计引物时，上游引物直接从这些个bp之后开始扩增（要自己在上游引物里添加ATG），这样得到的PCR产物是不带有信号肽的。

  • 小游abc (2013-7-05 11:10:56)

    表达的时候要去除真核的分泌信号肽，真核信号肽在原核中不能识别。？

    是这样的吗？师兄你能详细一点跟我解释一下吗？

  • Ao7 (2013-7-05 13:17:44)


    相关疾病：
    错位
    个人感觉要注意的是基因序列和实验设计本身。

    序列正确情况下要考虑到DNA序列在不同系统表达的差异。信号肽是个问题，但28a开始的那段可能已经把它作用给屏蔽的差不多。终止信号CDS上的是真核系统的，原核强度如何，要不要双终止？

    有时也要考虑一个问题，尤其是你插入序列融合在载体自身表达标签时，有没有错位？有时也会犯这种小错误的。

    然后，注意到，有的真核蛋白就是在一般的菌株表达不出，这个也不能排除。

  • 小游abc (2013-7-05 13:21:37)


    相关疾病：
    错位

    ===========================================================================================================

    个人感觉要注意的是基因序列和实验设计本身。

    序列正确情况下要考虑到DNA序列在不同系统表达的差异。信号肽是个问题，但28a开始的那段可能已经把它作用给屏蔽的差不多。终止信号CDS上的是真核系统的，原核强度如何，要不要双终止？

    有时也要考虑一个问题，尤其是你插入序列融合在载体自身表达标签时，有没有错位？有时也会犯这种小错误的。

    然后，注意到，有的真核蛋白就是在一般的菌株表达不出，这个也不能排除。

    ============================================================================================

    你好，如何考虑到DNA序列在不同系统表达的差异？小弟还不知道。谢谢你教导

    没表达，如何判断要不要双终止呢？

    错位是没有的，这是我最早考虑的问题，序列连在EcoRI后面。用vector NIT做重组质粒图谱和测序结果比对还是正确的。

  • tuuu2 (2013-7-05 13:21:58)

    一般来说，真核生物基因要做原核表达，最好都把信号肽去除，这是充分非必要条件。

  • 小游abc (2013-7-05 13:25:04)

    QUOTE:

    原帖由 tuuu2 于 2013-7-5 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    一般来说，真核生物基因要做原核表达，最好都把信号肽去除，这是充分非必要条件。
    小弟想和你请教如何预测信号肽？能否教教小弟如何去除信号肽。。。。。谢谢

  • tuuu2 (2013-7-05 13:25:27)

    信号肽预测网站cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/')把你的氨基酸序列放进去，然后submit。软件默认用2种算法分析信号肽位置。

    如果结果显示信号肽断裂在17aa-18aa之间，那么1aa-17aa就是信号肽。也就是说，1 bp-51 bp的基因序列需要去除。
    那么你就从52bp开始设计上游引物，记得自己添加个ATG。

  • 小游abc (2013-7-05 15:44:14)

    QUOTE:

    原帖由 tuuu2 于 2013-7-5 13:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    信号肽预测网站cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/')把你的氨基酸序列放进去，然后submit。软件默认用2种算法分析信号肽位置。

    如果结果显示信号肽断裂在17aa-18aa之间，那么1aa-17aa就是信号肽。也就是说，1 bp-51 b ...
    我刚刚用了你给我的网站，可是两种算法不一样，我应该如何取舍？
    谢谢你的教导

  • tuuu2 (2013-7-05 15:44:48)

    QUOTE:

    原帖由 小游abc 于 2013-7-5 15:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')


    我刚刚用了你给我的网站，可是两种算法不一样，我应该如何取舍？
    谢谢你的教导
    宁长勿短

  • 小游abc (2013-7-05 15:53:11)

    一般来说，真核生物基因要做原核表达，最好都把信号肽去除，这是充分非必要条件。

    =================================================================

    为什么要在前面再次添加一个ATG? 有什么作用，不是随信号肽去掉了，为什么还要添加？

  • tuuu2 (2013-7-05 15:53:33)

    关于ATG，它是起始密码子，有了它核糖体才能开始翻译。
    如果你要连接的载体，在多克隆位点前就已经有ATG了，那么你插入的序列就不用再添加了。有些载体在多克隆位点前没有ATG，那么就必须要加了。

  • nut6694 (2013-7-05 15:59:00)


    我遇见过一次，是我的IPTG放在4度时间长了，换了一只新的就好了。不知道你可能会有这种情况吗？

  • rxcc33 (2013-7-05 16:00:51)

    如果蛋白太疏水的话，要换更亲水标签的载体，如果蛋白有太多稀有密码子（大肠杆菌）的话，建议换成Rosetta，如果蛋白太大的话，建议别用原核表达了。。。
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