【讨论帖】贴出你WB做出来的条件和条带！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-7-06 08:50 作者: 轰轰来源: 分析测试百科网

我觉得我们实验室做WB摸索出来的条件，及所做出来的条带还是挺好的，所以先发个贴开个头！因为我看见园子里面老是有人在问做WB的条件，这样的话，就可以让新手们少走一些弯路！

跑胶：恒流一块胶 0.03A 二块胶 0.05A 转膜恒压 100V 封闭 5%的牛奶

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最新回复

轰轰 (2013-7-06 08:51:53)

错了，刚刚发的那张图片是我做的B-ACTIN
我是扫描的，格式是TIF，有高手指导一下，怎么改格式！

修改了一下，好了

74972224.gif

74972224.gif
轰轰 (2013-7-06 08:52:29)

再来一个

34495765.snap.jpg
NBA (2013-7-06 08:52:50)

请注明泳道和浓度比例方便大家分析
am10 (2013-7-06 08:53:17)

我这个条件，7.5% 10% 12% 15% 的胶都合适。泳道一共是10个，九个样品，最左边的泳道加marker ，加样品，跑出来就是这个样子。是给细胞加药，提蛋白，然后做WB,至于趋势我就自己分析了，呵呵
wmp1234 (2013-7-06 08:53:45)

完整的话，要加上抗体稀释比例吧？
子衿青青 (2013-7-06 08:54:09)

好漂亮，你蛋白怎么定量的？
说具体点
我的内参一直都不一致
biabiade (2013-7-06 08:55:48)

转膜多长时间啊？
阿司匹林 (2013-7-06 09:21:47)

图做得不错，但有几个建议和疑问：
（1）beta-actin和PCNA是用同一张膜先后做的吗？因为要进行定量分析，一般都要求这样做。
（2）PCNA的图好像有点斜，应该再略微调整一下。
（3）要进行定量分析，用quality one 就行。
阿司匹林 (2013-7-06 09:22:37)

这几个蛋白的分子量都不大，因此做起来比较容易，比较难做的是高分子量的蛋白。
轰轰 (2013-7-06 09:25:28)

我用的santa cruzs 的抗体，一抗二抗都是他家的。他家的抗体总体来说一般，一抗是1：1000 二抗 1：10000

关于蛋白定量的问题，我们实验室都是用BCA法，然后96孔板加样做曲线进行分析。

转膜恒压 100V 一个半小时足够，顺序：新买的一层海绵，二层滤纸，胶，二层滤纸，海绵。新买的海绵，二层滤纸足够了。

我们用的仪器室：BIO-RAD

对于大分子量，我们实验室做过有150KD多的，结果也不错的。

蛋白定量分析，可以用灰度分析就可以的。

另外，这两个指标的确不是在一张膜上做的，贴出来给大家看，就选了比较好看的，要知道做WB，有很多外在的因素影响，不可能保证每次都做出来完美无缺。

谢谢大家的支持！
H2O (2013-7-06 09:25:57)

QUOTE:
原帖由轰轰于 2013-7-6 09:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我用的santa cruzs 的抗体，一抗二抗都是他家的。他家的抗体总体来说一般，一抗是1：1000 二抗 1：10000

关于蛋白定量的问题，我们实验室都是用BCA法，然后96孔板加样做曲线进行分析。

转膜恒压 100V 一个半小时足够，顺序：新 ...
请问你们实验室150kDa的具体转膜时间和条件方法，很感兴趣，麻烦告诉我具体的步骤，多谢！
轰轰 (2013-7-06 09:28:07)

从刮细胞提蛋白开始到显影的步骤

提贴壁细胞蛋白

细胞裂解液的配方我园子里面贴过的，我是胃癌细胞

一般大皿加裂解液150ul，小皿100ul

加药后的细胞，用预冷的PBS洗三遍，然后放在冰上裂解45-60min

然后用细胞刮刮下，吸到1.5ml的EP管里面，然后低温离心机10000RPM/min 20分钟离心，离心完毕取上清，

BCA法测蛋白浓度，96孔板加样，做标准曲线，酶标仪波长562nm读数，求的所测蛋白浓度，选择最低蛋白浓度，加ddh2o,6*bf，沸水煮蛋白5min

放-20°保存以备用。

然后就是做WB的那一套，跑胶，转膜，封闭，加一抗四度过夜，二抗， ECL发光压胶片曝光。
轰轰 (2013-7-06 09:29:20)

150kDa的蛋白可以用7.5%的分离胶，跑胶还是一样，恒流一块胶 0.03A 二块胶 0.05A 转膜恒压 100V 转膜时间要长一些，因为大分子量的蛋白很难转，二个半小时到三个小时。我们用的PVDF膜
3648755 (2013-7-06 09:32:23)

我们实验室跑胶是用恒压60v，到分离胶就改为120v，转膜用恒流200mA，好像刚好和你们相反，请问有什么区别吗？哪种比较好呢？
zhezhe (2013-7-06 09:32:45)

我们实验室跑胶是恒流，转膜用恒压，条带时有时无。。。
any333 (2013-7-06 09:36:02)

我们做的120多KD的大分子，和内参一起做，电泳用恒压60V，转膜用0.35A，一个半小时或两小时。
我看楼主转膜用0.03A，相差这么大，那么楼主转膜需要多长时间，这两者间有差别吗？
bamboo16 (2013-7-06 09:36:36)

条带跑得不错，改格式的话用PS另存为时把格式改了
轰轰 (2013-7-06 09:40:36)

我们做的120多KD的大分子，和内参一起做，电泳用恒压60V，转膜用0.35A，一个半小时或两小时。
我看楼主转膜用0.03A，相差这么大，那么楼主转膜需要多长时间，这两者间有差别吗？

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我们实验室和你是反的，我们跑胶是恒流二块胶是0.05A ，转膜是恒压 100V，一个半小时足够了。

没什么差别，适合自己的就是最好的。
cwcwcww (2013-7-06 09:40:57)

请问楼主，你做的蛋白分子量是多大的啊？100V恒压转90分钟的那个是多少分子量的？