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【求助】TRIZOL提蛋白质问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-7-06 15:03    作者: qiangren789    来源: 分析测试百科网

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【求助】TRIZOL提蛋白质问题
各位师兄师姐你们好，我是用TRIZOL提蛋白质，按照下面的方法：
1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。取沉淀DNA后剩余的上清。用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
在第一步沉淀DNA中，离心后并没有分层，我试过好多次都是这样，请各位老师指点迷津。谢谢！
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最新回复

  • rxcc33 (2013-7-06 15:05:03)


    我正准备用这个方法同时提取RNA和Protein
    这么说要小心谨慎了

  • 49888 (2013-7-06 15:05:50)

    据我所知：核酸是不溶于66%以上的乙醇的，当溶液中含有盐离子时，核酸在70%酒精中是不溶的，但当溶液中不含于盐离子时是可溶的。不知你的样品来自哪里？你的无水乙醇有问题吗？

  • okhaha (2013-7-06 15:06:20)


    原则上是可以的，说明书上是这么说的，但操作起来也不是很容易的，偶也试过了，前几步一切顺利，最后收获a big pellet，但是很难溶解的呀，也就放弃了！反正样本充足～～

  • idea2011 (2013-7-06 15:08:02)

    我提过，分层是有的，提出来确实是一个big pellet,今天拿出来用。用的是双向的上样缓冲液来溶，结果一直振荡都不溶。big pellet分散在缓冲液中，就是不溶。
    不知道可不可以拿去水浴，或是超声促溶，不知道这样做蛋白会不会讲解。有没有哪位做过，请指教。

  • 831226 (2013-7-06 15:08:36)

    我后来提出来了，但确实不好溶。现改用买来的裂解液跑出来很好。

  • remenb (2013-7-06 15:09:18)


    我刚用此法提的DNA, RNA,PROTEIN.没问题, 只是PROTEIN 要及时提取,不要超过24H,否则很难溶解,另外PROTEIN 洗的时侯,要彻底,不要在PROTEIN 中留有TRIZOL(PINK).

  • remenb (2013-7-06 15:12:45)

    我想可能还是要及时提PROTEIN才好点.如果不是TISSUE太少,又要求RNA,DNA.只要得到PROTEIN的话换个方法提PROTEIN,可以少点麻烦.可用的方法又很多.不必为此浪费时间.

  • Ao7 (2013-7-06 15:13:09)


    我后来提出来了，但确实不好溶。现改用买来的裂解液跑出来很好。

    请问你买的是那家公司的那个品牌的细胞裂解液

  • Ao7 (2013-7-06 15:16:59)

    碧云天的产品怎么样

  • 33号 (2013-7-06 15:18:11)


    我用的protocol和楼主的基本是一样的。加了异丙醇后就可以看到明显的蛋白团块了。后面漂洗过程是比较麻烦，而且蛋白沉淀是很不好溶解。我是用1%SDS溶解蛋白质50℃温浴过夜，但还是溶解的不完全，就离心后直接取上清了。测蛋白浓度还可以，能做western。

  • 2541 (2013-7-06 15:18:58)


    1%SDS溶解蛋白质 加多少量呢？
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