【求助】关于应用HPLC技术进行氨基酸组成的分析

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• 49888 (2013-7-08 14:56:31)

  
  1. 不同的衍生剂影响应该不大,因为你定量时要用标准品.只要你最后的HPLC结果峰面积不要太小就行,太小定量不准.
  2 用6M/L的HCl水解,时间影响很大,太短,水解不充分,太长,引起氨基酸降解.
  3 用于分析的样品最好从层析柱上下来,然后,再跑个电泳看看纯度够不够,一般大于95%.测纯度时上样量要大于10 ug.另外,跑电泳时通常用到甘氨酸.应该有影响.

• idoww (2013-7-08 14:57:38)

  另外想请您看一下这样的电泳图纯度够不够？

  
  28605967.snap.jpg

• 49888 (2013-7-08 15:06:19)

  从图上看，似乎只有1条带。但感觉上样量太小。
  上样量可以再大一点，上样量太小的话，杂带看不出来，我最多的时候上过50 ug，一般上个20 ug，来做纯度比较合适。
  我不知道你的样品是如何得到的。
  
  我不知道你跑的是梯度胶还是等度胶，如果是等度胶的话，电泳的分离是有分子量范围的，太小的氨基酸片段，会跑的比溴酚蓝快，而检测不到。

• idoww (2013-7-08 15:07:09)

  我的样品是先用高氯酸处理后，经过两次离子交换柱获得，这也是参考文献做的，有点不同，文献上说他们用这个方法，最后用于氨基酸组成分析结果与国外报道一样，但我去做组成分析时两次都不对，差异很大，关键是水解时间的问题，这一点我也想到了，有书籍上说20-24小时后才可水解90％以上，但做的人说他们十几年都是这样做的只水解12小时，因为是免费的，自己也没有经验，也不好多说，不知道到底影响程度有多大。
  我用的是等度胶，怀疑有小的氨基酸片段，我也想到了，因为经过了高氯酸处理嘛。起还想到了有无核酸污染，但是用波谱扫描之后，发现波峰明显是在280nm，而260吸光度较低。考虑到有氨基酸片段和小的多肽，可能会在考马斯亮兰染色时反应不出来，所以在送检和跑电泳之前都经过了透析，透析袋孔径为8000-11000，而我的蛋白约50KD，我想小的片段应该已经除去了。
  现在我怀疑的重点也是水解时间的问题。
  上样量大时是会有一点的影子在后面，但是我肉眼观察至少可以说杂带小于10％以上，而关键问题是我现在的结果与报道相差太大，不是可以用10％的干扰可以解释的。
  请问楼上是做这个的吗？请问还有哪些可能的因素呢？
  万分感谢

• 49888 (2013-7-08 15:12:53)

  我不是做氨基酸组成分析的，我自己的样品也是送去让别人分析的，因为我怕自己做不好。不过我做过氨基酸分析，也做过水解，在这方面有些经验。水解除受时间影响外，还有1个重要因素就是温度。温度越高，水解时间越短。如果你担心水解不完全的话，可以用水解液跑个电泳看看，用20%的分离胶，看看还有什么带。另外，如果水解不充分的话，在测氨基酸组成的时候，会有杂峰出现在色谱图中。另外，测氨基酸组成通常要求纯度95%以上。蛋白不纯的话，对检测结果影响还是蛮大的。而且即使是纯度大于95%。测出来的氨基酸组成误差也是蛮大的，不会是每个氨基酸都对的上的。尤其是色氨酸。在水解时很容易遭破坏。

• idoww (2013-7-08 15:13:50)

  你说得太对了，第一次做的结果上确实有一个 很高的杂带，夹杂在16种非必须氨基酸之间（他们没有必须氨酸酸的标准），现在又有一个疑问，既然是水解不全的问题，那么为何这条杂带会出现在16种氨基酸的中间，而不是最后面呢？
  谢谢49888的解答，受益匪浅．

• 49888 (2013-7-08 15:15:59)

  
  HPLC 和电泳的分离机理不一样，不是按照分子量大小来分离的，所以出现在中间很正常。

• idoww (2013-7-08 15:17:49)

  
  那是按离子交换、亲疏水性？还望赐教。
  49888兄有这方面的资料吗，能否传一份来看看？
  再次感谢。

• 49888 (2013-7-08 15:19:49)

  一般氨基酸分析都用反相HPLC，我有一份agilent 公司有关氨基酸分析的说明书，但挺大，有3M多，怎么给你啊？

• ending (2013-7-08 15:21:09)

  不知楼主做氨基酸分析的目的是什么？鉴定目的蛋白吗？现在已经有许多更先进的方法，比如质谱。
  另外，氨基酸分析方法本身的误差比较大，对实验条件和操作过程要求非常严格。即使很有经验的技术人员，10-20%的系统误差也很正常，尤其是丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等，很难测准。