【求助】WB,分子量180KD的蛋白的转膜条件？

最新回复

• bling (2013-7-08 17:28:30)

  
  我以前也是转180kd左右的蛋白，半干转很难
  湿转比较好，我是25v恒压转2。5小时

• xueyouzhang (2013-7-08 17:29:35)

  
  绝对不加甲醇，
  350mA 1。5小时 BIO－RAD

• ending (2013-7-08 17:31:29)

  
  请教，为什么 不加 甲醇？
  我们用300mA，2h,湿转 ，北京六一的，效果不错

• xueyouzhang (2013-7-08 17:32:58)

  
  大分子量蛋白不加，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，小分子用甲醇效果好。

• greenbee (2013-7-08 17:33:28)

  大分子量蛋白不加，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，小分子用甲醇效果好。
  
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  请解释的再详细一点.

• flower-201 (2013-7-08 17:34:26)

  
  甲醇虽然可以帮助蛋白向膜转移，但是其容易在膜上的微孔上引起还原反应，妨碍大分子蛋白质与膜的结合。
  但是SDS可以帮助大分子蛋白向膜转移，故转移缓冲液中可不加甲醇，增加SDS.

• 987789 (2013-7-08 17:36:45)

  我还担心没人回答呢，多谢各位！
  转印缓冲液中不加甲醇的确有道理，我这里也是BIO-RAD的仪器，明天再试试看。
  还有一个问题：180KD的蛋白电泳时分离胶用10％，12％，8%的应该都可以吧？我看预染的MARKER都是可以分开的嘛，各位有何见解？

• 2541 (2013-7-08 17:37:28)

  
  提高高分子量蛋白转移效果有以下几种方法：
  甲醇在其中的作用是增加蛋白与膜结合的能力，可增加转移时间，防止胶变形，但其可降低高分子量蛋白的转移效率，个人认为可适当加10%-15%的甲醇，既增加蛋白的结合，对转移效率影响也不大。
  另可加入终浓度0.1%SDS，其可增加转移效率，但与甲醇作用相反，可减少蛋白与膜结合的能力。
  总之，你可甲醇和SDS 都适当加点，低浓度，我们一直这么做的，转移200KD左右的蛋白都没问题。

• 2541 (2013-7-08 17:37:45)

  我按楼上战友说的做礼物，可是仍没有结果，预染MARK最上面一条250KD的也是转上去的，那是怎么回事呢？内参42KD也做出来很亮的，难道是我的抗体失效了吗？

• avi317 (2013-7-08 17:42:10)

  请教，为什么 不加 甲醇？
  我们用300mA，2h,湿转 ，北京六一的，效果不错
  
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  我也用这个条件.

• 00无名指00 (2013-7-08 17:44:43)

  
  加20%的甲醇,恒压100V,转70分钟,最好用PVDF膜.

• greenbee (2013-7-08 17:45:07)

  
  刚刚看了上面几位大虾的经验,受益匪浅,在下有一相似问题,转膜80-110kda的蛋白,条件如何?另外,我的蛋白转膜经丽春红染色鉴定转膜成功,但显影后条带间分不太清,几乎成了一条连续的直线,而且背景较深,如何解决?

• plaa (2013-7-08 17:45:35)

  
  100mA，过夜，一定效果很好

• sunnyB (2013-7-08 17:46:14)

  我按MY-MAPK战友说的做礼物，可是仍没有结果，预染MARK最上面一条250KD的也是转上去的，那是怎么回事呢？内参42KD也做出来很亮的，难道是我的抗体失效了吗？
  
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  我也遇到同样的情况 希望哪位有经验的大侠指点迷津 谢谢