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【求助】关于印迹膜再生液的使用
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发表于: 2013-7-09 16:45 作者: hustwb 来源: 分析测试百科网
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【求助】关于印迹膜再生液的使用
各位老师大家好,不知道有没有谁使用过膜再生液的?
我最近的电泳跑得都还行,就是从杂交开始就不行了,想用膜再生液把膜重新处理后再次杂交,各位用过的前辈能不能给点注意事项啊?
谢谢各位!
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【求助】关于印迹膜再生液的使用
我也来说两句
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最新回复
8princess8
(2013-7-09 16:45:44)
楼主杂交那步的时候怎么就不行了?
另外what is 膜再生液?是让膜上蛋白恢复活性的?恢复抗原性的?还是洗掉抗体用的?我估计是最后一种吧,如果你没有发出条带来,说明没有抗体结合,如果不是膜已经干了,就不用什么再生,直接重做没有关系。
hustwb
(2013-7-09 16:54:01)
电泳和转膜都非常成功,从杂交开始不好的意思是说一抗二抗浓度控制不好,所以不想不停的跑电泳,只需要好好调抗体浓度就行,
再生液在western 好像目前只有一个功能的吧,还有蛋白恢复活性的么?
3648755
(2013-7-09 16:54:21)
我们用的再生液好象主要成分是Tris 18.15g + SDS 3.03g + 巯基乙醇 配成500ml,
使用时候在50度下温育30分钟,效果非常好。
我是膜再生后染actin ,条带非常清晰,原来的抗体都洗掉了。有张膜再生了两次,都还不错。
hustwb
(2013-7-09 16:54:59)
能否把你们的具体配方告诉我们啊,呵呵
另外:您能跟我们讲讲stripe洗膜的原理么?是仅仅洗掉二抗么?还是连一抗也洗掉了?
做western 如果不用stripe洗膜,第一个抗体杂交完毕后,PBST直接洗完后杂交第二个抗体行不行呢?
非常感谢
89tongzijun
(2013-7-09 16:55:34)
hello,为什么不是用0.8M的NAOH洗膜呢?bigman的配方第一次见呢,好用吗蛋白不会洗掉啊?
3648755
(2013-7-09 17:05:44)
等我看看,挺好用的。蛋白还在,但肯定是少了一些,但用来染actin应该问题不大。
3648755
(2013-7-09 17:06:05)
一抗应该是掉了,蛋白可能也少了一些。
66+77
(2013-7-09 17:06:34)
实验室是直接买的膜再生液,30min洗膜,然后重新杂交~
ququer787
(2013-7-09 17:08:28)
用30%双氧水也可以呢,在蛋白面加个2ml左右,37°10Min,处理一次绝对没问题,但具体能重复这样操几次就不清楚了
S6044
(2013-7-09 17:08:55)
我们用的再生液好象主要成分是Tris 18.15g + SDS 3.03g + 巯基乙醇 配成500ml,
使用时候在50度下温育30分钟,效果非常好。
请问巯基乙醇的量是多少?
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【求助】关于印迹膜再生液的使用
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8princess8 (2013-7-09 16:45:44)
另外what is 膜再生液?是让膜上蛋白恢复活性的?恢复抗原性的?还是洗掉抗体用的?我估计是最后一种吧,如果你没有发出条带来,说明没有抗体结合,如果不是膜已经干了,就不用什么再生,直接重做没有关系。
hustwb (2013-7-09 16:54:01)
电泳和转膜都非常成功,从杂交开始不好的意思是说一抗二抗浓度控制不好,所以不想不停的跑电泳,只需要好好调抗体浓度就行,
再生液在western 好像目前只有一个功能的吧,还有蛋白恢复活性的么?
3648755 (2013-7-09 16:54:21)
使用时候在50度下温育30分钟,效果非常好。
我是膜再生后染actin ,条带非常清晰,原来的抗体都洗掉了。有张膜再生了两次,都还不错。
hustwb (2013-7-09 16:54:59)
另外:您能跟我们讲讲stripe洗膜的原理么?是仅仅洗掉二抗么?还是连一抗也洗掉了?
做western 如果不用stripe洗膜,第一个抗体杂交完毕后,PBST直接洗完后杂交第二个抗体行不行呢?
非常感谢
89tongzijun (2013-7-09 16:55:34)
hello,为什么不是用0.8M的NAOH洗膜呢?bigman的配方第一次见呢,好用吗蛋白不会洗掉啊?
3648755 (2013-7-09 17:05:44)
3648755 (2013-7-09 17:06:05)
66+77 (2013-7-09 17:06:34)
实验室是直接买的膜再生液,30min洗膜,然后重新杂交~
ququer787 (2013-7-09 17:08:28)
用30%双氧水也可以呢,在蛋白面加个2ml左右,37°10Min,处理一次绝对没问题,但具体能重复这样操几次就不清楚了
S6044 (2013-7-09 17:08:55)
我们用的再生液好象主要成分是Tris 18.15g + SDS 3.03g + 巯基乙醇 配成500ml,
使用时候在50度下温育30分钟,效果非常好。
请问巯基乙醇的量是多少?
【求助】关于印迹膜再生液的使用