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【求助】caspase-3 western blot 求助!
最近caspase-3的western blot,结果32kd的条带出来了,而且处理组的条带也淡了很多,但cleaved 条带没出来,郁闷之极啊!我用的12%的胶,转膜100v,45min。请教各位高手,你们都是怎么做的?感谢之极啊!【求助】caspase-3 western blot 求助!
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最新回复
yes4 (2013-7-16 13:09:59)
caspase-3的cleaved条带没出来可能性比较多.
1.可能caspase-3根本没激活.
2.可能你的抗体不对头.不知你买哪家的,象CST都写着这个抗体是针对procaspase还是cleaved caspase.
3.可能浓度不够,所以太淡.问题也可能出在二抗、ECL、显影液等
个人感觉santa的caspase-3似乎质量稳定性不是特别好。
如果western做不出来,可以试试一些荧光试剂盒
dongdongqiang (2013-7-16 13:10:22)
和楼主一样,用santa的做不出来
现在换了cst的,还没出结果
lixi559 (2013-7-16 13:11:10)
101010 (2013-7-16 13:11:30)
caspase3的抗体哪的最好出阿?
qianqin1977 (2013-7-16 13:12:03)
blocking buffer 你用什么? 还有一抗稀释液你用什么?我用了1%BSA 溶液,我做cleaved 条带是出来
lixi559 (2013-7-16 13:12:43)
我block用的5%脱脂奶粉(in TBS/T),一抗稀释也是这个。还有个问题,收细胞的时候,上清中的漂浮细胞是不是也要收起来,一起提取蛋白?
nut6694 (2013-7-16 13:13:41)
yysr238 (2013-7-16 13:14:36)
请问bioworld的caspase 3抗体怎样啊?32kd和cleaved 条带都能出来么?
memory (2013-7-16 13:15:20)
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我买的是Epitomics公司的,用的效果还不错。
S6044 (2013-7-16 13:16:07)
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应该是把漂浮的细胞液收集起来吧?请问现在已经能做出好的结果了吗?最近本人也在做caspase3,活化片段也没有出来。12%的分离胶,电泳低压80,20分钟,高压120 ,80分钟,转膜80fu,60分钟,这样的条件重复过几次都没有压出小片段来,用丽春红将膜染色结果显示只到34KD左右有条带,在考虑是电泳时间不够?还是转膜时间太长?这种情况该怎样调整?本人新手,请大家指教。
changlhsyo (2013-7-16 13:16:51)
我用的cst的,还可以。开始做时,能看到cleaved ,y样品用过几次,就不见了,可能是反复冻融降解掉了。可以重新制样做一下,祝ok
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