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【求助】western结果非常怪,大家帮忙分析一下
最近做western,结果总是有问题,背景很花,以前用进口滤纸的时候满好的,现在用新买的滤纸(生工买的专门用于western的滤纸,是普通滤纸的三倍厚),用了三层(是不是太厚了),用三层是因为厚度与原来用的进口滤纸厚度差不多。PVDF膜用甲醇浸泡过的。缓冲液也是每次新配的。一抗4度过夜。清洗也蛮彻底。现在不知道问题出在什么地方,下面是图,请大家帮忙分析一下。【求助】western结果非常怪,大家帮忙分析一下
[ 本帖最后由 redbutterfly 于 2013-7-16 18:22 编辑 ]
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最新回复
101010 (2013-7-16 18:22:59)
转膜时又没有降温措施,凝胶有没有皱缩
xue258 (2013-7-16 18:23:25)
我用的是mini VE的转印系统,转印blot外面加了1L的水,电泳槽外用冰水浴的,降温应该还可以,我原来转印blot只加了300ml缓冲液也还可以,后来看说明书上讲外面直接加水就可以了
sunnyB (2013-7-16 18:24:27)
2。甲醇泡完之后在转膜液中的时间要长,甲醇没有泡干净的后果就是转膜之后带漂移,试一下甲醇5min,transfer buffer 1h。
3。把小镊子的头用封口膜包一下,看你的第二张图,有印子不太好,尤其是不小心夹到你的目的带的时候。
tie8 (2013-7-16 18:24:49)
redbutterfly (2013-7-16 18:25:16)
bling (2013-7-16 18:25:36)
我用四层滤纸都没有任何问题
我觉得再查一下曝光时候的红光和用的胶片
看看有没有问题
guagua (2013-7-16 18:25:53)
我一般都是直接泡了甲醇后,蘸一下转印buffer
没什么问题啊
guagua (2013-7-16 18:27:48)
你可以用丽春红染膜看看,是不是膜上的条带就这么乱
如果不是,那问题肯定出在你转膜之后
如果没有丽春红也可以用R250染色
u76mp (2013-7-16 18:28:21)
如果不是,那问题肯定出在你转膜之后
如果没有丽春红也可以用R250染色
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同意上面的说法
图都这样了,就不要来回曝光了。分析原因吧。
建议你一步一步的来,先确定胶跑的好,如果确定了,再确定其他的。
【1】先用考马斯兰染一下胶,看胶上的情况怎么样,如果胶上的蛋白就不好的话,就不要往下做了,先把电泳之前的事情搞明白。看你的图,问题出在哪里的可能性都有,但是我感觉电泳都没有搞好的可能性很大。所以强烈建议用考马斯兰染胶,看胶上的情况。
【2】 如果胶上的蛋白经过染色之后发现挺好的,这样再转膜。然后用丽春红染色看膜上的情况,如果膜上的条带不好,就分析电泳和转膜之间的事情。如果膜上的蛋白是好的,那问题就出在转膜之后,这样查找问题点范围就缩小了。
【3】滤纸的厚度适中就可以了。我用的是原装的滤纸,用一张。
【4】现在我感觉要先确定问题出在哪里。确定了问题在哪里,这样就可以集中经历,研究问题出在哪里了。这样分析问题,意义估计大一些。问题容易解决一些。
【5】染完胶和膜,把结果跟大家一说,大家也好分析。象现在这样大家也是只能猜,因为问题出在哪里的可能性都有呀。
loli (2013-7-16 18:29:36)
redbutterfly (2013-7-16 18:30:47)
any333 (2013-7-16 18:31:58)
考虑一下更换膜。从别的实验室借一张膜试试。同时彻底清洁你孵育一抗和二抗的容器。
Ao7 (2013-7-16 18:32:18)
电泳没问题,看来是转膜出错。
1
放三明治时仔细检查下绝对不能有气泡。
2
所用的海绵和滤纸应提前20-30min置于湿转液中浸泡。
3
三明治要夹紧了,以上夹板的时候用上50-70%的手劲儿为宜。
4
海绵一般不会出错的,尤其是你们实验室其他人用着没出问题的情况下,不过实在不行就考虑更换。
5
滤纸的厚度和层数没有定数。以达到夹紧三明治为宜。
6
膜的问题:PVDF只需要在甲醇中浸泡几秒钟就可以完全浸润,膜不再发白,你的膜怎么浸润这么慢?是不是甲醇有问题?要用纯甲醇,不带稀释的啊!
我大胆的推测下:似乎是因为膜和胶之间局部有缝隙,蛋白从胶中电泳出来后弥散在缝隙中的缓冲液里,然后又被转移到膜上。或者膜没完全浸润,蛋白无法牢固附着。
redbutterfly (2013-7-16 18:32:38)
谢谢大家的帮助!问题解决了,是海绵用久了变薄了的原因,后来换过海绵就好了!
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