【求助】non reduced 比 reduced的蛋白要大？

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• qqq111 (2013-7-19 10:43:53)

  1, 具体点你是怎么定义reduced的？
  2，差别这么小，有没有可能是样品或者胶造成的呢？

• daod (2013-7-19 10:44:15)

  
  不好意思，可能没有说清楚，reduced只是多加了2ME而已
  
  不会是跑胶的原因，因为每次跑都是这样的会有一个shift，大概已经跑了有6-7次了。
  
  即便是我最后纯化后的蛋白跑胶也是这个样子的。
  
  所以基本可以排除第二点。

• qqq111 (2013-7-19 10:44:35)

  
  不得不再问： 如果reduced是加了2ME,
  那么 non reduced 是不加2ME吗？就是什么都不加的正常细胞吗（对照）？

• daod (2013-7-19 10:45:00)

  
  对，reduce和non reduced 就是这一个区别
  
  “什么都不加的正常细胞吗（对照）？”这个好像不太对，这些就是纯蛋白的。我做的是原核表达，包涵体复性后跑的纯蛋白的图。只是15% SDS-PAGE而已。

• daod (2013-7-19 10:45:27)

  
  你把人说糊涂了。还是别兜圈子了，你就直说了吧，2ME是加到细胞培养液中还是蛋白裂解液里面？两组处理有何不同，你加2ME的目的是什么，预期两组会有什么区别？

• daod (2013-7-19 10:46:08)

  
  先多谢楼上的支持
  好像楼上的跟我讨论的不是一个事情。这个2ME只加在上样的Loading buffer里的。
  与细胞貌似没有什么关系，这个只是为了看一下蛋白质复性的效果。2ME可以打开二硫键。
  预期来说non reduced 会比 reduced的要小才对。

• qqq111 (2013-7-19 10:46:34)

  先多谢楼上的支持
  好像楼上的跟我讨论的不是一个事情。这个2ME只加在上样的Loading buffer里的。
  与细胞貌似没有什么关系，这个只是为了看一下蛋白质复性的效果。2ME可以打开二硫键。
  预期来说non reduced 会比 reduced的要小才对。
  
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  你说明白了问题不就简单了嘛。
  这样的话我就可以推测你这个蛋白很可能含有分子间二硫键了。

• daod (2013-7-19 10:47:10)

  
  多谢，但是还是有几个不太明白的地方
  这个蛋白有10个半胱氨酸，是可能形成有分子间的二硫键。
  不过如果要是形成分子间的二硫键它的non reduced的分子量应该是至少是二聚体的大小才对？但是从胶上看似乎并不是这样。
  或者我的这种观点是错误的？只要在表达时形成了分子间二硫键蛋白的NR的大小一般就会大于R的？
  等待解答。
  另外楼上的也经常做原核表达么？是否有很多的PET载体呢？

• daod (2013-7-19 10:47:47)

  
  不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。
  不知道这个是不是可以解释。