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【求助】求WB高手指点。。。蛋白拖尾。。
最近做WB电泳时老有东西堵在上样口（如图）不过跑上10分钟后上样口的东西又渐渐的看不见了，到分离胶就变得很正常。【求助】求WB高手指点。。。蛋白拖尾。。
也尝试过一些方法如：1、用RIPA稀释蛋白 2、增加losding buffer中SDS的含量 3、加等体积2×的LB ;都解决不了。
不知道问题出在哪里，都有两三个月了都这样。
最近做的是小鼠肝组织蛋白，动物实验重复起来很耗时，希望有好心的WB高手赐教，不胜感激！
RIPA配方：Tritox-100:1%,SDS 0.1%,EDTA 5M,NaCl 150mM,Tris-HCl (PH7.4) 50mM,脱氧胆酸钠 1%。
4*loading buffer:Tris-HCl (PH6.8) 0.2M,SDS 8%,溴酚蓝 0.4%，甘油40%v/v。
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最新回复
Ao7 (2013-7-19 11:29:27)
因为照片上看不太清楚，我怀疑是蛋白浓度太高或者气泡或者是浓缩胶，导致你在操作过程中上样体积不均一，影响最后结果。 如果不是的话你的蛋白浓度是多少呢？按照你前面说的用用RIPA稀释蛋白不管用应该不是蛋白浓度的问题。感觉上面RIPA和loading buffer配方也没什么问题，如果蛋白样品的问题请你再仔细观察观察是你上样品之前是没排出上样孔道中的气泡还是梳齿没拔好留了浓缩胶在孔道里导致蛋白拖尾的？
DONT (2013-7-19 11:30:16)
如果显色后正常，应该就没什么大问题。应该是因为梳齿没拔好留了浓缩胶在上样孔造成的！
wood533 (2013-7-19 11:30:37)
很可能是蛋白质受SDS结合的影响，可改用Tricine-甘氨酸电极缓冲液试试。
finger (2013-7-19 11:36:23)
JK.jon (2013-7-19 14:55:16)
abc816 (2013-7-19 14:55:40)
建议裂解完样品以后12000离心10分钟取上清，沉淀弃掉。当然如果你的蛋白如果在沉淀里，可以将沉淀再溶解上样。
其次，配胶的时候可以将浓缩胶多配点，而且拔完梳子，一定记得用注射器或者上样枪将上样孔里吹干净！！
cwcwcww (2013-7-19 14:56:08)
加上样缓冲液的样品有沉淀，高速离心，即可解决。
王蜜蜜 (2013-7-19 14:58:38)
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拔完梳子后都用水洗过上样口应该不是浓缩胶留在上样口的问题。
cwcwcww (2013-7-19 14:59:45)
建议裂解完样品以后12000离心10分钟取上清，沉淀弃掉。当然如果你的蛋白如果在沉淀里，可以将沉淀再溶解上样。
其次，配胶的时候可以将浓缩胶多配点，而且拔完梳子，一定记得用注射器或者上样枪将上样孔里吹干净！！
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那裂解时如何避免沉淀呢，每次上样前都14000rpm离心15分钟。
hot_hot_hot (2013-7-19 15:00:12)
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沉淀是不可避免的，总会有一些裂解不掉的，你第一次裂蛋白时就应该离心取上清
shenkunjie (2013-7-19 15:02:38)
样品有高浓度的DNA/RNA，建议用超声波破碎仪处理一下再上样。
shenkunjie (2013-7-19 15:03:26)
2个方面着手找问题：
1、离心，样品沸水煮5-10min后，10000离心后再上样。SDS制样，也会有很多不溶的沉淀出现。
2、pH值。准确测试一下三个地方的pH值，上层胶一般在pH 6.8,弱酸性，下层胶 pH 8.3。同时样品buffer（RIPA和loadingbuffer）pH值也应该准确到8.3.
如果pH值不准确，由于离子解离的原因，会导致拖尾
又看了你的回复，你样品是离心后再上的，那就是pH不对。pH值非常重要。
再就是国产pH试纸非常非常之不准确。
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