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本人第一次跑二
维，操作完全是按照biorad的电泳手册来的。提取的HaCaT细胞全蛋白。提取物丙酮浓缩除盐后发现难溶，而且浓度达不到要求。于是用3KD的透析膜过滤。上样量1.25mg。PH3-10的IPGstrip
聚焦程序：
250V线性30min
1000V快速1h
10000V线性3h
10000V快速6000V-hr（因为电压一直在7300-7800V左右上不去，所以这一步实际上跑了8h）
PAGE胶用的10%，没有浓缩胶。
程序：
5ma X 30min入胶
30ma X 4h30min跑到底
R250考染
结果如图（黑色的圈和锐利的小痕迹就无视吧，那是染色盘上面的瘢痕）
感觉点很少，但又不像是上样量的问题。因为好多地方黑糊糊的一坨。
另外，我看了一下我们实验室前人的电泳方案。发现几个问题
1、一是盐桥的必要性：盐桥理论上应该是增加导电性的，但是像我这样电流过高电压上不去的增加导电性难道不是导致电流更高？
2、而是聚焦程序：我们那位师兄当年聚焦用的是：600V线性2h；3500V线性4h；3500V线性1h28min。样本为纯化线粒体
但是我看伯乐的电泳手册上说的聚焦电压应在7000V以上，总伏时数至少60000V-hr。不知上面的聚焦程序对不对？
3、有的人聚焦结束后先进性第一步平衡然后再冻存胶条？是什么目的？
4、silverblue和普通考染相比优势在哪？
新人问题比较多，望各位高手不吝赐教。 谢谢了
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56760495.snap.jpg
最新回复
moonlight45 (2013-7-20 15:43:31)
2，聚焦程序是根据胶条的长度以及样本的特性进行设定的，这个要稍微的摸索下，不能照搬的
3，聚焦完毕以后，如果不立即第二向的话，就可以把胶条放进-20度或者-80度保存，等要进行二向的时候再临时解冻10min就OK了，这么做对实验不会有任何影响的，因为蛋白已经被胶条保护起来了，并且是-20以下保存就不会有问题了
4，胶体考染比普通考染的灵敏度更高些，建议考染还是选择胶条考染，至于银染的灵敏度就更高了，上样量也少的多，普通考染的灵敏度在40ng,胶体考染的灵敏度在10ng
ha111 (2013-7-20 15:44:38)
之所以说浓度达不到要求是因为手册上的上样量要求蛋白溶液200ul，而上样量要达到1-3mg，所以其浓度至少要达到5mg/ml。
当然，我不知道当水化上样液体积不变的时候，能不能通过增加样品溶液的量来提高上样量。因为手册上写的是：400ul水化上样缓冲液+100ul蛋白样品溶液。
也许可以在水化上样缓冲液体积不变的前提下通过增加蛋白样品溶液的量来提高上样量？或者等比增加水化上样缓冲液和蛋白样品溶液的量来增加上样量（但是这样总的体系体积就比较大了，不知道教条能不能吸收这么多液体？）
望赐教
moonlight45 (2013-7-20 15:44:58)
胶条的上样体积有个参考范围，一般按照技术手册的参考范围来，比如24cm的胶条其上样体积是450ul,你就可以先计算一下你需要上多少ug的蛋白需要多少体积的蛋白溶液，然后用总体积450ul减去蛋白上样体积就是你要补的水化液的量，水化液一方面是是用来补足的体积的，两方面也是起到上样缓冲液的缓冲作用，这个量可以不固定的。
ha111 (2013-7-20 15:46:23)
我是17cm的胶条。手册推荐的上样体积是500ul
而我的初提蛋白样品溶于裂解液中，其浓度为2.5mg/ml，因此要达到至少1mg的蛋白上样量，那么我可以采取400ul蛋白样品溶液+100ul水化上样缓冲液混合来进行水化上样？
ha111 (2013-7-20 15:47:21)
顺便问问。看文献上silver blue胶染用的是G250。不知道用R250行不行？
glass (2013-7-20 15:47:58)
我17的胶条，300水化液，50样品。
你是否可以尝试一下提蛋白的时候，适量减少点裂解液的体积，以增大一点蛋白的浓度呢。。。
我觉得从你的图来看，上样量足够了，明显是等电聚焦不够好。
盐桥有用来除去微量盐离子的作用，还是需要加一下的，盐浓度过大才会导致电压升不上去的。
ha111 (2013-7-20 15:48:59)
因为考染需要1-2mg的上样量。我已经试过两千万的的细胞使用1ml的裂解液进行裂解。发现浓度与两千万细胞2ml裂解液裂解是一样的。所以都是采用
提取以后透析浓缩的办法来提高浓度。有时一次透析达不到浓度要求还需要进行两次透析。
总感觉要在100ug样品溶液里面达到1-3mg的上样量确实比较麻烦。多次透析可能低丰度蛋白损失也会比较严重吧？
等电聚焦的过程伏时数是达到了。但是聚焦步骤最高电压只有7500V左右。不知道会不会有影响.....
avi317 (2013-7-20 15:49:54)
之前 跑过细胞的双向电泳，采取的处理办法是饱和醋酸铵沉淀法，结果还不错。
上样量：我跑24cm的胶条，一共就上1mg蛋白，上样体积450ul。胶体考染就很清楚了，满足分析需要。
对于你的结果
1：个人觉得样品的制备存在一定的问题。样品的蛋白浓度还是要高一点比较好，这样上样所加样品的体积小，减少样品中本身存在的杂质干扰。样品盐浓度过高电压也会上不去。我们木有采用盐桥，不是很了解。
2：聚焦程序跟我们不太一样，觉得你的不是很对啊，前面的低电压也有除盐的作用，觉得你的电压升得太快了一点。给你做个参考，这个是我们做细胞的。
24cm PH3-10 100V 1h
250V 1h
500V 1h
1000V 1h
3000V 1h
5000V 1h
Gra 8000V 2h
8000V 80000vhr
500V 维持至取出胶条
后面的两个问题，上面的战友已经回答了。
ha111 (2013-7-20 15:50:25)
先用100ml去离子水溶解硫酸铵，搅拌了半个小时才勉强溶解。但是一加入甲醇G250溶液硫酸铵立马又析出来了。而且还是一边搅拌边慢慢倒进去的。
最后整个体系拿磁力搅拌器搅了两小时才算没有沉淀。
但是染色的时候发现染液不是普通考染液那种均一的蓝色。而是存在大量微小的蓝色细颗粒。不知道是不是正常的。
www.1 (2013-7-20 15:51:44)
有点像猪链的样本。
你的点少，可能是定量不准，
电压上不去，说明离子强度大，你得多沉淀几次了。
另外，如果IEF做不好，不要考虑染色的问题。
gogo (2013-7-20 15:52:22)
先用100ml去离子水溶解硫酸铵，搅拌了半个小时才勉强溶解。但是一加入甲醇G250溶液硫酸铵立马又析出来了。而且还是一边搅拌边慢慢倒进去的。
最后整个体系拿磁力搅拌器搅了两小时才算没有沉淀。
但是染色的时候发现染液不是普通考染液那种均一的蓝色。而是存在大量微小的蓝色细颗粒。不知道是不是正常的。
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配液的时候，甲醇到最后再缓慢加入，应该没有那么难溶的。
有蓝色细颗粒是正常的，放心用。染液放一段时间后，会发现细颗粒呈片状沉淀，这时候染色效果就不好了。
ha111 (2013-7-20 15:53:07)
就是就是，大量的细颗粒存在
静置一天以后就沉淀了，上层染液变成可透视的淡蓝色....
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