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【求助】帮忙看看我的2-D电泳图，到底出了什么问题？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-7-20 16:23 作者: 红茶可乐来源: 分析测试百科网

上周做了一组2-D电泳（组织溶于lysis buffer，上样量80ug，加了IPG buffer和Destreak，IEF胶条pH 4-7，条件水化10hr，500v 4hr，500-1000v 1hr，1000-8000v 4hr，8000v 20min。平衡液1和2，分别15分钟。），看到结果迷糊了，一团一团黑乎乎的，（正常情况下会有很多蛋白点，这量张胶感觉大多数蛋白点都没跑出来，都是一团团黑）。不知道出了什么状况？我想可能是样品的问题，细胞系的样品跑的很好，这个是人组织样品，最近新弄的，不知道是不是因为有杂质的关系。有经验的大家们帮忙看看，给点意见。我不敢再试着做了，胶太贵了。

[ 本帖最后由红茶可乐于 2013-7-20 16:27 编辑 ]

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【求助】帮忙看看我的2-D电泳图，到底出了什么问题？

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ritou1985 (2013-7-20 16:27:53)

1，你的水化时间偏短了，一般我们水化时间至少保证12h，才能保证蛋白充分进入胶条；,
2，你的聚焦时间也很短，8000V才20min,不知道你是不是用的GE推荐的程序跑的，那个时间太短了，我们都会自行调整的，从你的图谱来看，你的聚焦也不好；
3；你的试剂是不是有杂质污染，怎么会有那么多黑点充斥在整个图谱中？
红茶可乐 (2013-7-20 16:28:18)

QUOTE:
原帖由 ritou1985 于 2013-7-20 16:27 发表
1，你的水化时间偏短了，一般我们水化时间至少保证12h，才能保证蛋白充分进入胶条；,
2，你的聚焦时间也很短，8000V才20min,不知道你是不是用的GE推荐的程序跑的，那个时间太短了，我们都会自行调整的，从你的图谱来看，你的聚焦也不好；
3 ...
谢谢你的建议，我觉得应该是我处理组织样品的时候没用PBS清洗，因为当时只是为了跑western blot，所以没仔细处理样品。我重新用组织又做了样品，试了试PBS洗4次，明天出结果再看看。对了问你一个问题，我用bio-rad，4-20%的胶跑，没看住时间，大概多跑了能有10多分钟吧，会不会把下面的蛋白都跑丢了，会跑丢多少？
zhezhe (2013-7-20 16:28:54)

请问楼主，你10多分钟是跑了多少的电压？电流啊？没有溴酚蓝指示吗？
ritou1985 (2013-7-20 16:42:32)

谢谢你的建议，我觉得应该是我处理组织样品的时候没用PBS清洗，因为当时只是为了跑western blot，所以没仔细处理样品。我重新用组织又做了样品，试了试PBS洗4次，明天出结果再看看。对了问你一个问题，我用bio-rad，4-20%的胶跑，没看住时间，大概多跑了能有10多分钟吧，会不会把下面的蛋白都跑丢了，会跑丢多少？

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不知道你二向设置的电压是多少，一般我到第二步的时候，用200v的电压，整个二向跑到底的时间大概在6小时，我们用的板子是GE的，宽是20cm，这样算一下就知道大概每分钟能跑多长的区域的凝胶，不过越到后面是大分子，跑的要慢些，一般10min,不会跑出多少的蛋白，如果你的电压比我设置还要低的话，那就更没问题了。
你这张图本打算是用来跑Western的啊，那制备蛋白样品用的试剂必须要满足双向制备样品的的要求。
红茶可乐 (2013-7-20 16:59:52)

请问楼主，你10多分钟是跑了多少的电压？电流啊？没有溴酚蓝指示吗？

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电压是200v，蓝色条带我根本没机会看到，跑没了。
红茶可乐 (2013-7-20 17:00:27)

不知道你二向设置的电压是多少，一般我到第二步的时候，用200v的电压，整个二向跑到底的时间大概在6小时，我们用的板子是GE的，宽是20cm，这样算一下就知道大概每分钟能跑多长的区域的凝胶，不过越到后面是大分子，跑的要慢些，一般10min,不会跑出多少的蛋白，如果你的电压比我设置还要低的话，那就更没问题了。
你这张图本打算是用来跑Western的啊，那制备蛋白样品用的试剂必须要满足双向制备样品的的要求。

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是啊，是跑western的样品。我的是 11cm的，200v平时跑50分钟正好跑完，这次一个小时我才停止。胶是bio-rad 4-20%的。
ritou1985 (2013-7-20 17:16:53)

不懂你的胶是4-20%？怎么还是个区间？不是固定的浓度？
红茶可乐 (2013-7-22 11:14:34)

QUOTE:
原帖由 ritou1985 于 2013-7-20 17:16 发表
不懂你的胶是4-20%？怎么还是个区间？不是固定的浓度？
不是固定的，是买的胶由上到下的浓度4-20%。我的结果出来了，到那白点也多了，黑呼呼地东西也不见了，但是还是有几条横纹贯穿整张胶，不过比较浅。什么原因呢？pH 4-7，11cm胶条。
JK.jon (2013-7-22 11:14:57)

我个人觉得你这个胶首先杂质好像没有除干净，IEF的时候前两部一般要用100V-300v的电压除盐，除杂质，你这个好像没有，另外聚焦时间太短了，20min的这个聚焦程序可能有些问题，水化时间我觉得稍微延长一点试一试也是可以的！
tangxin_80 (2013-7-22 11:15:17)

聚焦时间太短了吧？