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【求助】WESTERN结果无法重复的难题
【求助】WESTERN结果无法重复的难题
一直在做WESTERN,以前目的蛋白(大小40kd/60kd)的显色都很理想。可是,本周以来样本再也没有结果。一抗、二抗都重新配置了,还是不行。并且膜用丽春红作了预染,转移效果还好。请问这是怎么回事?
我的考虑:1我们使用PBST洗膜的,今天测了一下ph似乎偏低,7.0左右,有影响吗?2蛋白的处理方面,我是将细胞用pbs洗2次后,2xSDS上样BUFFER收集样品,超声粉碎(其中产生了气泡,会有影响吗?),沸水煮10分钟,12000rpmX10m离心,去沉淀。有问题吗?蛋白会降解吗?可是一直以来我们实验室都是这样处理样本的。
实在不知道原因是什麽?难道一抗失效了!请各位高手帮忙分析一下吧!
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最新回复
49888 (2013-7-22 13:56:00)
1. Positive control(以前成功detect过的样品)结果如何?如果ok的话,primary ab/PBST/etc.应该没问题,就是本批样品处理的问题吧?
2. 我以前遇到过的情况有一个就是 ponceau staining还ok,但是最后结果很差,最后不断实践发现,由于我run了胶之后,没有把胶以及membrane在transfer buffer里泡一段时间,就直接transfer去了(我用的是semi-dry法),这样做的结果是蛋白仿佛transfer到膜上去了,但是stay的不好,洗一段时间就掉了, 因为能从molecular weight marker蓝色逐渐变浅看出来。后来改进之后效果超好。(这只是我自己遇到的情况,仅供参考)
3. PBST,T的含量请降低,通常是0.1%? 可降至 0.02%. 原因是,Tween20应该是detergent,可以帮助去掉background但是也会妨碍ab的binding吧?不过如果你一直都这么用,应该没啥问题了吧?
4. 如果想尽办法都不行,我重新自己配所有要用的buffer,调准pH。
ha111 (2013-7-22 13:56:19)
可能是,你的蛋白样本里没有蛋白酶抑制剂,蛋白降解,只剩下了蛋白骨架。所以后一次做不出来。也可能是,你才用的显色方法不行。可以改成超敏发光也曝光显色。
kulee (2013-7-22 13:56:40)
TNT (2013-7-22 13:57:07)
其次,怀疑Buffer的话,可以在ECl未出结果时,重新用丽春红预染,观看结果。以证实蛋白条带的存在与否。
另外,ECl最长时间曝光,一支到背景变灰,这样可以诊察浅条带。如果仍是一片白,高度怀疑二抗问题,下次可以更换抗体试试。
bring (2013-7-22 13:57:36)
“把胶以及membrane在transfer buffer里泡一段时间“
楼上群友的建议是15分钟。
kulee (2013-7-22 13:58:00)
谢谢大家!
我们是用红外发光检测D!
目前已将以前做出结果的膜STRIPPING 后复染,没有结果!
突然想起PBST如果是纯水+吐温会有影响吗?想了想除了PBST是实验室新来的配的,其余都已重新核实过了!
langlang (2013-7-22 13:58:31)
除了楼上的建议以外,还建议你用PBS洗膜,在冰浴下超声破碎(最好加入PMSF或EDTA等蛋白酶抑制剂),间隔时间最好是超声时间的2倍(有利于热量扩散)。
kulee (2013-7-22 13:58:56)
重新配置了pbs后问题解决了!看来试验处处都仔细!
3N4G (2013-7-22 13:59:46)
额外问一句,用PBST好还是TBST好?有人比较过么?
youyou99 (2013-7-22 14:00:08)
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utt0989 (2013-7-22 14:01:05)
QUOTE:
上样太少。 加大上样量,提高一抗浓度。【求助】WESTERN结果无法重复的难题