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【讨论帖】 膜蛋白WB实验时 内参选择问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-7-22 16:04    作者: 7437654    来源: 分析测试百科网

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【讨论帖】 膜蛋白WB实验时 内参选择问题

如题，这是一个老问题了，但是还想跟大家讨论一下，因为我在园子里搜索了一下，以前的讨论没有得出一个让大家都满意的结论。

用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白之后，进行WB实验，是否可以用β-actin或者GAPDH等做内参？

先说说我的看法：
1、如果是提取的总蛋白，然后做WB，用β-actin或者GAPDH做内参肯定是没有问题的，这是公认的东西。

2、如果用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白，再用β-actin作为内参似乎不妥，因为理论上来讲β-actin在膜上是不表达的。WB能做出β-actin来是因为膜蛋白提取时把胞质蛋白也提出来了。然而，如果我们试验目的是用药物处理细胞，比较处理前后某种膜蛋白的表达情况，此时用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白后再用β-actin做内参似乎就不妥了，因为你根本不知道药物处理前后混杂了多少的胞质蛋白进来。如果没有胞质蛋白混进去的话，β-actin就是检测不到的。

3、是否可以用GAPDH？目前大家都认为他是跟β-actin一样的，既然β-actin不妥，那么GAPDH也不行啦。但是，我要说点自己的看法：在数据库里查了一下，发现GAPDH不止定位在胞质中，而且胞核和膜上都有！（见链接：cuturl('http://www.uniprot.org/uniprot/P04406')）这是不是说明了可以用GAPDH作为内参，虽然他并不单纯定位于细胞膜上，但至少在膜上有表达，起码比选用β-actin合理一些。

想听听大家的看法。另外，有没有其他更好的内参可以推荐一下
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最新回复

  • 7437654 (2013-7-22 16:34:37)


    其实这是一个很重要的学术问题，希望大家畅所欲言

    用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白之后，进行WB实验，用GAPDH做内参是否合适？如果不合适的话，到底有没有什么其他蛋白可以担当内参的角色？

  • birdfish (2013-7-22 16:34:57)


    这个问题也一直困扰着我

    同样还有胞外蛋白的内参问题。

    等待高人出现解惑

  • xiaoxiaoniao (2013-7-22 16:35:15)

    提取膜蛋白后，仍以β-actin做内参，其丰度显著减少。

    同样困惑，期待高人指点！

  • xyw5 (2013-7-22 16:35:37)


    β-actin 内参不是万能的 。
    左心室心肌细胞冒失不表达 β-actin

  • DONT (2013-7-22 16:35:58)


    楼主的观点很正确，β-actin 和GAPDH 是肯定不能用的，貌似建议用“钠钾ATP酶离子通道蛋白”做内参的比较多。

  • one (2013-7-22 16:36:28)


    内参没有公认的，根据实验不同，内参不同，内参的真正意义在于在你的样品中这种蛋白的含量相对固定，不受处理因素的影响。“不受处理因素影响”才是关键，如果你研究的是药物对细胞骨架的影响你也选用actin（公认？）。认识了内参的意义，才能选出合适的内参。

  • wmp1234 (2013-7-22 16:37:02)


    学习了，听我在国外实验室待过的师姐说，在国外实验室，做WB之前，要用其实验室所有的内参拿来做一个预实验，哪个内参表达稳定，就用哪个。有时候，管家基因真的不一定管家。

  • S6044 (2013-7-22 16:37:19)


    我曾经听一个牛人说：在没有得到确切的问题解决时，actin还是一个很好的内参，可以适用胞浆，胞膜，总蛋白。因为你找不到比这个更合理的内参

  • dotaaa (2013-7-22 16:37:40)

    胞外蛋白怎么办呢？用什么做内参？

  • flower-201 (2013-7-22 16:38:03)

    QUOTE:

    原帖由 dotaaa 于 2013-7-22 16:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    胞外蛋白怎么办呢？用什么做内参？
    直接做ELISA，如果有Kit的话。。。。。

  • PINK (2013-7-22 16:38:27)

    有些人提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取，更细的还有膜蛋白什么的，不提取总蛋白，所以做内参要选择相应部位表达稳定的蛋白。实际情况中，任何一种试剂盒或自配的提取液，都不可能完全将胞浆、胞核蛋白等完全分离开，提取时总会有交叉污染。就是提取的核蛋白肯定会有beta-actin，而胞浆蛋白也会有核蛋白的存在，所以说用extraction比protein更为恰当。同样的，膜蛋白的制备过程也存在一样的问题。现在文献中对这个问题没有足够认识的人不在少数，同样多派意见依然存在，用“不很科学”的方法做内参也可能都能有结果，只是其存在是否足够合理，将来投稿是否有足够的说服力来“搞掂”审稿人而已。
    据个人的了解，建议做各种蛋白时可供选择的内参，不妥之处请指出。
    1). Cytoplasmic and whole extraction: 肌动蛋白actin , GAPDH、tubulin 等常用。其中actin也分为多种，好像是6种，各亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。平时最多见的还是用beta-actin了，但各位的研究对象不同，可能在选择时还是需要稍稍注意一下较为合适的内参。
    2). nuclear extraction: 组蛋白Histone H1，核纤层蛋白laminA/B/C ，nucleoprin p62类的、caveolin、也还有人用c-Fos ，较少见。
    3). membrane extraction: Na-K ATPase （一种整合膜蛋白）。

  • 7437654 (2013-7-22 16:38:58)

    http://www.antpedia.com/?action-channel-name-groupbbs-gid-6

  • veiwu (2013-7-22 16:39:20)


    其实我有同样的问题一直困扰着，我还想问下您所用的膜蛋白试剂盒是哪个公司的？可以提供型号给我吗？谢谢！

  • 7437654 (2013-7-22 16:39:48)

    QUOTE:

    原帖由 veiwu 于 2013-7-22 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    其实我有同样的问题一直困扰着，我还想问下您所用的膜蛋白试剂盒是哪个公司的？可以提供型号给我吗？谢谢！
    我用的是Fermentas的Proteo JET membrane protein extraction kit (#K0321)，可以用来提取胞质蛋白和膜蛋白，但是我按照说明书操作完之后，发现这个kit提出来的膜蛋白浓度明显高于胞质蛋白，也不知道这样提出来的胞质蛋白能不能用。

  • veiwu (2013-7-22 16:40:08)


    是吗？那你之后有没有鉴定下到底提取出来的是不是膜蛋白呢？还有你每次提取能得到的膜蛋白浓度大概有多少啊？谢谢了！

  • 7437654 (2013-7-22 16:40:33)

    QUOTE:

    原帖由 veiwu 于 2013-7-22 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    是吗？那你之后有没有鉴定下到底提取出来的是不是膜蛋白呢？还有你每次提取能得到的膜蛋白浓度大概有多少啊？谢谢了！
    刚提出来没几天，测了下浓度都在0.7mg/ml左右，WB正在做

  • yapuyapu (2013-7-22 16:40:58)

    直接做ELISA，如果有Kit的话。。。。。

    ===============================

    我要做好几个指标，大部分都没有kit呢。
    即便有的有，买的也忒贵了……

  • veiwu (2013-7-22 16:42:02)


    这样子啊，那浓度还可以啊，等你结果出来的话可以跟我说下不？如果好用的话我就试试！谢谢了！

  • gogo (2013-7-22 16:45:09)

    胞外蛋白怎么办呢？用什么做内参？

    ================================================

    可以直接定上清总蛋白量，上一样的蛋白量的时候可以不用内参

  • uaubc (2013-7-22 16:45:32)

    也有的是不用内参的，western时上同样量的蛋白
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