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【求助】TCA/丙酮沉淀,蛋白为什么不溶呢?
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大家好,我用0.2%DTT,10%TCA的丙酮溶液沉淀蛋白后,为什么蛋白就是不溶呢??一直是离心后的那种块状,不能被溶解开啊,大家知道是什么原因吗??我的裂解液成分是:9M尿素,1%DTT,4%CHAPS,0.2%CA,沉淀后干燥12分钟,室温溶解了6个小时候,还是块状,大家指教下啊!
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最新回复
jrwyyplt (2013-7-23 11:17:33)
加一点NAOH就可以了 很快就会溶的
89tongzijun (2013-7-23 11:17:54)
QUOTE:
这样是不是引入了,新的离子啊 ,会影响双向吧xyw5 (2013-7-23 11:18:15)
用0.2M 的NAOH 根据沉淀的量加几ul就可以了 影响不大 我有的样品要调pH 100ul样品中加0.5M NAOH 1ul对IEF没有影响 你可以根据你的样品摸索一下
lixi559 (2013-7-23 11:23:07)
没有为什么,就是溶不了。尤其不能等丙酮干了再加裂解液,坚决不能溶
如果跑双向,建议超声助溶
如果酶解,就直接加酶吧
所以去盐之类的,如果能够超滤就不要沉淀
ending (2013-7-23 11:23:27)
是不是干燥过分了,这个也会影响溶解的?室温溶解6小时,这个时间也太长了。此外你的Urea的浓度偏高了,最好是9M以下,或者是尿素和硫脲一起使用也行,因为高浓度的尿素很容易析出结晶的
89tongzijun (2013-7-23 11:23:48)
QUOTE:
谢谢啊,请问你们提取时候都加硫脲了吗??bs4665 (2013-7-23 11:24:08)
尿素和硫脲联用的话一般收7M尿素 2M硫脲
ending (2013-7-24 10:45:06)
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这个可以加,也可以不加,若两个都加的话,就用7M Urea和2M Thiourea,若是单独使用的话,就用8M Urea就可以了,不要超过9M,不然尿素很容易析出结晶
89tongzijun (2013-7-24 10:48:52)
QUOTE:
恩,谢谢啊,不过我没换裂解液提出来了啊 ,我在另一个帖子上,给你上图啊,这个也上张吧,你看看这个效果怎么样啊 ,我就是把那个丙酮沉淀物,重新用液氮研磨,然后裂解,浓度达到4mg/ml了,不知道这个图是不是什么不足啊,请给评价下啊这分别是又重新提了两次,浓度是提高了,只是下面这个是液氮研磨溶解,上面那个是剪碎溶解了,不知道你们有什么看法啊
38284322.jpg
59769372.jpg
ending (2013-7-24 10:50:10)
液氮研磨蛋白溶解的更充分些,这是肯定的了,你说你用9M尿素,也提出了蛋白,但是这个不能就此说明这个浓度就一定可行,有可能会影响你后面的聚焦,有可能,我说过,这个浓度高的话,会析出结晶,影响聚焦。
89tongzijun (2013-7-24 10:50:49)
QUOTE:
恩,明白了,我下次就用8M的尿素啊,谢谢前辈指点啊 ,不知道液氮研磨那个蛋白块,会不会造成蛋白的降解,或者其他的什么影响啊?ending (2013-7-24 10:51:20)
液氮研磨不会造成蛋白的降解,对后续的实验基本没有影响,放心去用吧
qqq111 (2013-7-24 10:53:44)
请问一下LZ 是用什么BUFFER溶解的呢
89tongzijun (2013-7-24 11:00:38)
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谢谢啊,另外请问下,我这缺少高分子量蛋白,不知道前辈认为是什么原因啊 ??这是牛的肌肉蛋白
89tongzijun (2013-7-24 11:01:53)
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你好啊,就是常用的那种啊,8M尿素(有时候也用9了),4%CHAPS,0.2%CA,1%DTT,蛋白酶抑制剂,pmsf什么的
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