【求助】western blot 曝光雪花样背景，怎么回事？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-7-29 17:17 作者: wiwi 来源: 分析测试百科网

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【求助】western blot 曝光雪花样背景，怎么回事？

最近做的WB实验结果，出现了雪花样的背景(如下图），不知道是哪出了问题?
抗体应该是没问题的，之前也没出现过这情况，而且一张膜剪切做了三个不同的蛋白都是这种情况。膜也是TBST 按10min x3次来洗的。封闭不全的问题我想应该也不是。我想是不是脱脂奶粉久了，变质了问题。或者有其他原因，请高人指点，叩谢！

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NBA (2013-7-29 17:19:53)

洗液问题，需要过滤。Splotchy backgroundcaused by insufficient washes and/or unfiltered blocking solution. Can be
improved by filtering the blocking solution through 0.2 μm filter and adding extra washes.
我在这个帖子里面写得很清楚，你们不愿看。
cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/20537059?onlyHost=1')
wiwi (2013-7-29 17:20:30)

谢谢，那个帖子和小册子的确很好！不过好像也不全是洗涤液也就是TBST的问题，奶粉溶解不好应该也会导致这个问题，不过不知道还有没有其他原因。我是胶片曝光，不是机器曝光的。
biabiade (2013-7-29 17:20:53)

我最近也在做这个，应该是没溶解好的原因吧
redbutterfly (2013-7-29 17:21:20)

可能有如下的可能性：

1 TBS配置或者TBST配置有问题

2 封闭液没有配置均匀

3 显影液定影液配置时没有经过过滤
wiwi (2013-7-29 17:21:57)

QUOTE:
原帖由 redbutterfly 于 2013-7-29 17:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
可能有如下的可能性：

1 TBS配置或者TBST配置有问题

2 封闭液没有配置均匀

3 显影液定影液配置时没有经过过滤
多谢，不知道TBST配置哪里可能出现问题，吐温有可能出现问题吗？还有显影液定影液如何过滤。另外其实我很怀疑是抗体的问题，因为同时间段做过内参，内参做得不错，没有背景。
xiaoxiaoniao (2013-7-29 17:23:47)

我也在做wb，也经常遇到深背景！！甚至有交叉！
wiwi (2013-7-29 17:24:13)

内参如果不是同一张胶，就不能说明太多问题。因为也许就是这一张胶的问题。除非你多次重复都是如此的脏。

其实不管是封闭问题，还是抗体问题，都可以通过强化洗涤来解决的（TBST一般是不会有问题的）。

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谢谢!内参就是同一张胶转的同一张膜的，做的时候目的蛋白和内参膜剪开做的。还有目的蛋白我做过好多次都是有点状背景的。
vivian4123 (2013-7-29 17:25:00)

QUOTE:
原帖由 wiwi 于 2013-7-29 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
内参如果不是同一张胶，就不能说明太多问题。因为也许就是这一张胶的问题。除非你多次重复都是如此的脏。

其实不管是封闭问题，还是抗体问题，都可以通过强化洗涤来解决的（TBST一般是不会有问题的）。

==================== ...

这显然就是一抗的问题了。
好办，把一抗再稍稀释下，洗涤一抗时再加点力就好了。