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【求助】是二抗导致的背景高不?
请各位高手帮我指点指点:【求助】是二抗导致的背景高不?
最近做了两个蛋白的印记,一个actin 、一个目的蛋白
一抗 都是santa cruz的
二抗 皆是北京中衫 actin是羊抗兔、目的蛋白是兔抗山羊
两个蛋白是同时转膜(因为actin的条件没那么苛刻,就跟随目的同一块胶做了),同时抗体孵育,同时曝光,同时洗膜10min
结果,actin爆出来的条带非常漂亮,几乎没什么背景,而目的条带的膜就通体发亮,条带几乎看不到,想了好多方法去解决,没能爆出好看的条带,这两个蛋白,就是在二抗上不一样,难不成是 二抗的特异性不高
有没有这个可能??
请做过的支招
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最新回复
greenbee (2013-7-29 17:55:10)
可能是你的蛋白封闭液有问题!
也有可能是一抗的问题,建议换一个一抗看看,或者找santacurz公司
vvmmoy (2013-7-29 17:59:37)
我们遇到的问题和你一样,因为
1.actin是单克隆,纯化很好,特异性强,所以条带很好
2.目的蛋白可能是多抗,特异性不强,非特异性结合较多,纯化也不及actin好,所以条带不佳
近来中杉的SANT CRUZ的抗体普遍存在这个问题,我们整个实验室都是这种情况
3.建议更换一抗,单克隆的效果会好一些
lxh031 (2013-7-29 18:00:54)
最近做了两个蛋白的印记,一个actin 、一个目的蛋白
一抗 都是santa cruz的
二抗 皆是北京中衫 actin是羊抗兔、目的蛋白是兔抗山羊
两个蛋白是同时转膜(因为actin的条件没那么苛刻,就跟随目的同一块胶做了),同时抗体孵育,同时曝光,同时洗膜10min
结果,actin爆出来的条带非常漂亮,几乎没什么背景,而目的条带的膜就通体发亮,条带几乎看不到,想了好多方法去解决,没能爆出好看的条带,这两个蛋白,就是在二抗上不一样,难不成是 二抗的特异性不高
有没有这个可能??
请做过的支招
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好多天前就支过招了,看《实战指南》。
2L你最好也去读读,明显是他的抗体稀释液配方不对;不要再纠缠什么封闭液了。
3L 单抗多抗都可能黑板,如果效价不高,其粘附效果是一样的,都可能黑板。actin唯一的好处是丰度高,所以在碰撞粘附的过程中,竞争优势太明显。也因为丰度高,制备抗体相对容易,本来非特异就低。
S6044 (2013-7-29 18:01:12)
plaa (2013-7-29 18:01:48)
QUOTE:
看了你写的东东真是佩服,我反思到,我的细胞蛋白使用的提取直接就吸弃完全培养液没用pbs洗即提取总蛋白了,目的蛋白含量不高,照你的分析应该里面含有着高浓度的BSA,在一抗孵育的过程中,BSA与目的蛋白的一抗竞争而非特异性结合,从而导致整膜都亮,可是在这里我有个问题:BSA在细胞总蛋白总,他也是有一定的分子量的,通过SDS-PAGE电泳,他难道不能拉成一条直线,反而搞得整张膜亮亮的,来干扰目的蛋白的显现吗?这该如何理解呢?plaa (2013-7-29 18:08:23)
你的问题,我专门分析过白板和黑板。你的抗体适用黑板的情况,首先可能抗体不太好,其次你用的封闭蛋白不适用你的抗体,你必须更改稀释液配方,等你按照我的说法改完了,再来判断到底是不是抗体的问题。
“2.WB结果白板(无信号)和黑板(高背景)。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题(当然也可能与ECL显影有关,此点下一节有阐述),白板主要是可能是抗体本身效价不高,或者抗体稀释液中封闭蛋白过多,竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性的一抗,特异性条带和非特异性背景同样结合强度——无信号。黑板,也主要是因为抗体效价不高,而抗体稀释液中封闭蛋白的拮抗作用又没有完全发挥,此时无法有效识别抗原的一抗会等效的粘附转印膜的任何位置,显影后整张膜全黑。
有时候膜接近全黑,但可以若有如无的观察到靶蛋白,出现问题的原因虽然仍是抗体效价不高,封闭蛋白不能完全起到作用,不过此时可以通过改变抗体稀释液的配方,提高特异性和非特异性结合的信号差异,降低背景。”
“目前,抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk,BSA和gelatin,似乎很少的样子 。。。可是,你有没有考虑过“复方”?——这下配方无限多了吧。
1. 采用milk,BSA和gelatin的单方。3% milk,5% BSA,<=0.4%的gelatin,并根据实际情况改变(若出现白板,请降低封闭剂浓度。;黑板多加)。gelatin大家可能比较陌生,不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方,你会发现很多抗体溶液里都有它。
2.很多情况下单方的浓度很高了,背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的,比如gelatin+BSA时,gelatin浓度不能无限提高(会完全竞争掉抗原抗体特异性结合,导致白板),BSA的浓度较随意。
3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST,也可用高盐浓度的缓冲液(NaCl 0.5M)以降低背景;但是切记,有的抗体对盐浓度敏感,包括构象和溶解度,因此需要尝试。
如果以上策略仍然无法解决高背景,可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料(新的)放在一起孵育个把小时再用。如果还不行,彻底无解,结论抗体太差;请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。”
去买gelatin,用gelatin封闭膜;把抗体稀释在gelatin/TBST里面,我估计要用gelatin+BSA的复方。
bohe221 (2013-7-29 18:08:51)
2L你最好也去读读,明显是他的抗体稀释液配方不对;不要再纠缠什么封闭液了。
3L 单抗多抗都可能黑板,如果效价不高,其粘附效果是一样的,都可能黑板。actin唯一的好处是丰度高,所以在碰撞粘附的过程中,竞争优势太明显。也因为丰度高,制备抗体相对容易,本来非特异就低。
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我细看了下,他的目的蛋白是羊抗的,而我做了几次羊抗,也是这个效果,不知道学长做羊抗有什么具体的心得
u76mp (2013-7-29 18:09:25)
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鼠抗、兔抗、羊抗或者驴抗等等都一样。只是每一种抗体,不同公司的,甚至同一公司不同批次的(尤其几个经常转包别人实验室自制品的公司)都不一样,自己去摸索抗体稀释液的配方吧,没别的更好的办法;要么就是买贵点品质有保证的公司的
c86v (2013-7-29 18:09:50)
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老大你好!
我做了很久的WB目前结果仍然是差强人意。
最初是DAB显色,条带太弱。换用ECL后,总是整张膜的荧光,看不到目的条带,但内参很亮,而洗膜后用DAB显色也可见到目的条带,只是很弱。
是不是我的问题也出在封闭的问题上了?
ukonptp (2013-7-29 18:10:41)
不用封闭 提高二抗稀释度(1:20000-30000) 如果不行就考虑一抗的问题
【求助】是二抗导致的背景高不?