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WB实验步骤【分享帖】免疫印迹（WB）案例分析
目的蛋白分子量(kd)：170（细胞浆，细胞膜均表达）
1.制胶
分离胶：8% 浓缩胶：5%
2.蛋白样品制备
沸水煮沸： 5 分 变性
3.上样量： 20微克
4.电泳
压缩胶电压：80v 时间：32分
分离胶电压：100v 时间：109分
5.转膜（湿转，20%甲醇）
恒流：200毫安 时间：3小时
7.洗
1X TBST 1*3分
8.封闭
1*TBST/5%奶粉 RT*2小时（温度约20度）
9.洗： 5* 5 分
10.一抗孵育
稀释液：封闭液 稀释比:1比一千 4度过夜
11.洗
1X TBST 5* 5分
12.二抗孵育
稀释液：封闭液 稀释比：1比1万 RT*2小时
13.清洗
1X TBSＴ6*5分
14.显影，定影
结果见下
2009-11-08实验步骤
目的蛋白分子量(kd)：170（细胞浆，细胞膜均表达）
上样量：25微克
电泳
压缩胶电压：80v 时间：33分
分离胶电压：110v 时间：48分
转膜同上
封闭同上
洗膜：3*5分
一抗孵育
稀释液：1*TBST 稀释比:1比500 1比800 4度过夜
洗膜：4*5分
二抗孵育
稀释液：1*TBST 余同上
洗膜：5*5分
结果见下
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87021055.jpg
最新回复
NBA (2013-7-31 10:25:08)
26995826.snap.jpg
NBA (2013-7-31 10:25:34)
69724036.snap.jpg
NBA (2013-7-31 10:26:33)
符结果如下
90676742.snap.jpg
NBA (2013-7-31 10:26:55)
更正：中间图片为一抗 一比500，最下方为一比800(一抗说明书推荐：1：200-1000)
二抗均为一比一万。鉴于11-08，06的结果，11-20我把上样量调低为20微克，一抗下调为一比一千。蛮以为会出张较好的条带，哪晓得出的结果完全超乎想象，感觉11-20的条带并非目的蛋白!现在完全不晓得11-20的问题出在哪儿了：抗体浓度过低？封闭过度？洗脱过度？还是其他。甚是费解！
特请各位大虾指导，非常谢谢！
bs4665 (2013-7-31 10:27:20)
就我个人的实验经验来看，出现这样的结果有可能与转膜有关系，因为转膜电流过大后产热过多会造成结果边缘模糊像糊掉一样，再有就是有必要测试一下TBST的PH值，这对洗脱结果直接影响。抗体浓度只要是能够出现条带就没问题，量（在适用范围内）只影响条带的明暗。封闭主要影响最后背景，影响结果的可能性较小，这是我的一点认识希望有帮助。
NBA (2013-7-31 10:27:40)
非常感激 您说的一些细节我一直都没注意到 这就去测试测试！
NBA (2013-7-31 10:28:01)
顺便问请教下TBST的PH 在多少为宜！
ququer787 (2013-7-31 10:28:27)
我们是PH7.4，做的挺好的
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