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【求助】酶切回收
最近做质粒酶切，需要两种酶，但不能同时双酶切，因此采用单酶切，请问单酶切后用下列方法能否回收dna片断后进行第二次酶切：【求助】酶切回收
1. 加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1），充分混匀离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
2. 加入等量的氯仿/异戊醇（24 ：1），充分混匀。
3. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
4. 加入1/10量的3 M NaOAC（pH5.2）。
5. 加入2.5倍量的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
6. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
这种方法回收会不会损失其中的小片断？
乙醇沉淀有没有更简单的步骤？
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最新回复
linlinstar (2013-7-31 10:40:17)
我常用的方法：
1、加入等量的氯仿/异戊醇（24 ：1），充分混匀。
2、离心，取上清，加入两倍体积的无水乙醇/3M NaAC(9:1)，混匀，-20度或- 70度放置 20 分钟以上。4度离心15分钟左右，收集沉淀。
3、用75%的乙醇洗一下
4、如果DNA量比较少，可以在加入9：1之后再加1~2ul Glycogen（甘糖原），可以辅助 DNA 沉淀，效果不错的。
+小生怕怕+ (2013-7-31 10:40:45)
由于你两种酶的缓冲液体系不同，所以你的主要目的是更换缓冲液，而不是去除其他蛋白（因为如果缓冲液相同，两种酶可以在同一体系中工作）。
所以你只需要乙醇沉淀（加1/10体积的3 M NaAC），再用75%乙醇洗涤后，复溶，就可以用做下步酶切了。
ritou1985 (2013-7-31 10:41:13)
所以你只需要乙醇沉淀（加1/10体积的3 M NaAC），再用75%乙醇洗涤后，复溶，就可以用做下步酶切了。
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有人认为酶里边的甘油含量过高会影响酶的活性，况且酶本身也是一种蛋白，那么只用酒精沉淀能去除这些影响吗？欢迎继续讨论。
+小生怕怕+ (2013-7-31 10:42:02)
乙醇沉淀后，原体系中的甘油已经除去了。
酶还有没有活性并没有什么关系，因为如果两种酶缓冲液如果相同的话，是可以在同一体系中双酶切的，现在不能双酶切的原因是缓冲体系不同。
乙醇沉淀后，只是相当于你使用适合第二种酶的缓冲体系，进行了双酶切，而你又不必考虑第一种酶的效率有多少！
windy+++ (2013-7-31 10:42:20)
我们是胶回收后进行第二次酶切，也有用乙醇＋NaAc沉淀的，效果都不错。
xue258 (2013-7-31 10:42:40)
第一次酶切后先做一下热失活然后再沉淀，效果应该更好一些。不要认为内切酶只有内切活性，它还有痕量的外切酶活性。
hot_hot_hot (2013-7-31 10:42:57)
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