【求助】pGEX4T1 GST融合蛋白表达和纯化

最新回复

• cocacola (2013-7-31 10:45:04)

  
  从图上看那个26KD就是GST标签蛋白，目的蛋白不见了的最大原因就是不稳定降解了，而且随着洗脱处理的延长，洗脱下来的蛋白基本上都是GST了，融合蛋白反而更少了。从图上看你的融合蛋白好像也没有98KD吧。

• nikonun (2013-7-31 10:45:26)

  我的融合蛋白是有98kd的，我比过分子量标准的，那条红线大约是95左右。我在诱导后，菌放在4度过了夜，第二天才做的，用压榨的方法破碎细胞的，用Glutathione Sepharose 4B纯化的，纯化后用终浓度为15％的甘油－20度保存，大约两三天后才跑胶做western的，你觉得是降解了吗？ 要是降解 那GST也该降解掉呀

• pencil菲 (2013-7-31 10:45:45)

  难怪会出现这种情况，并不推荐－20度保存蛋白溶液，因为这样的条件下即使有甘油也避免不了蛋白的逐渐损失，不知道当时你保存蛋白时候溶液中蛋白的浓度能有多少，最好不要少于0.5mg/ml。

• 131415 (2013-7-31 10:46:48)

  
  也许破碎或者保存不当导致GST融合蛋白没活性所以挂不上,破碎后样品马上纯化试试,或者破碎不完全或者不是可溶解表达,总之留意样品本身的问题.

• jujuba (2013-7-31 10:47:07)

  
  楼主的问题我也碰到了，超声处理后，目标蛋白就变小了，变的很小。
  我怀疑是降解了。

• nikonun (2013-7-31 10:47:39)

  谢谢以上几位的热心，前几天由于有事 所以试验做的不够紧凑，纯化完我没有测定浓度的，原想跑胶看看，大概估算一下浓度。现在我又开始诱导表达了，这次准备表达结束就纯化然后跑胶western。
  
  不知道你是怎么保存纯化后的蛋白的？
  你的问题后来怎么解决的？

• yychen (2013-7-31 10:48:42)

  
  长期保存蛋白或者抗体我都是冻干后，－20度保存。短期保存蛋白，一般要将蛋白浓缩后，直接放置在－80度保存两个星期左右，最好不要超过一个月就用于后期的实验，尽管这样后期的SDSPAGE显示蛋白仍然有不定程度的降解。

• yychen (2013-7-31 10:49:04)

  我的融合蛋白是有98kd的，我比过分子量标准的，那条红线大约是95左右。我在诱导后，菌放在4度过了夜，第二天才做的，用压榨的方法破碎细胞的，用Glutathione Sepharose 4B纯化的，纯化后用终浓度为15％的甘油－20度保存，大约两三天后才跑胶做western的，你觉得是降解了吗？ 要是降解 那GST也该降解掉呀
  
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  "我在诱导后，菌放在4度过了夜，第二天才做的" ————如果不能立即纯化的话可以离心后直接把菌体沉淀放在零下20度。
  我们最长放过好几个星期的都没问题。

• kuaizige (2013-7-31 10:49:48)

  
  楼主的问题好像跟我的一样：纯化前蛋白很多，纯化后几乎没有了。
  看来相似的问题很多。我的理解是：1、蛋白太大了以后结合Glutathione Sepharose 4B的能力就会降低
  2、蛋白太大了空间构象把Glutathione Sepharose 4B结合的位点覆盖了导致不能结合

• nikonun (2013-7-31 10:51:04)

  
  谢谢楼上几位的热心。我正在重做，会及时更新结果。 这次我就是收菌后放－20度保存的。6606357战友，你觉得98kd的蛋白Glutathione Sepharose 4B很难纯化吗？ 有没有这方面的资料。谢谢！

• hot_hot_hot (2013-7-31 10:51:32)

  QUOTE:

  原帖由 nikonun 于 2013-7-31 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  谢谢楼上几位的热心。我正在重做，会及时更新结果。 这次我就是收菌后放－20度保存的。6606357战友，你觉得98kd的蛋白Glutathione Sepharose 4B很难纯化吗？ 有没有这方面的资料。谢谢！ ...

  只是我也有这方面失败的经验，100kd左右的蛋白纯化不出来，可能是蛋白太大了，我只有一本GST手册，如需要可以传给你

• gogo (2013-7-31 10:51:56)

  
  看了您的图和您的实验说明后觉得在这些方面您可以改进下:
  1.由于细菌里有好多的蛋白酶,为了防止您的目的蛋白在胞内被降解,一般收菌后,都应保存于-20度,或-80度;一个月内,您什么时候破碎都行. 所以,您的菌放四度,估计目的蛋白被降解太多,从您的western上来看,26KD-98KD之间有好多带,那些都是目的蛋白降解造成的(GST一般比较稳定,相对而言),您的WESTERN应该用的GST抗体吧.
  当然还有人说是提前终止造成的GST蛋白的出现(就是您26KD的位置),在纯化前您的western上已有26KD带,但不可能纯化后就一点目的蛋白就没了,所以还是您的目的融合蛋白不稳定,容易被降解,最好能加点抑制剂混合物,有时光加PMSF没用,还有就是操作迅速,低温操作.
  2.个人觉得GST融合蛋白大了不容易纯化好象没有什么理论依据,我也纯化了不少GST融合蛋白,其中也有大分子的融合蛋白,但没有楼上说的这种,一般挂的不好,主要存在于GST融合蛋白包涵体中，由于变复性不好,蛋白折叠不正确,挂不住,这还比较常见.
  3.蛋白的保存是个难题,主要还是看蛋白的稳定性,对大多数蛋白来说,避免反复冻融是比较重要的.长时间保存的话可以滴加到液氮中,形成小球,保存于-80度,可保存几年没问题(国外的经验).
  祝好运!

• 小游abc (2013-7-31 10:52:17)

  我也遇到这样的问题，破碎完后，上清和沉淀里都有目的蛋白，沉淀量大，上清少，用GS4B纯化结合后，结合后上清再次跑电泳，上清还是存在跟跑之前一样粗的目的条带，最后洗脱液里仅仅有很少量的目的蛋白，很是郁闷，就是挂不上去？？！！！！