【求助】Ni柱结合不上目的蛋白如何处理

最新回复

• dog002 (2013-7-31 17:25:55)

  
  下次麻烦给电泳图作一说明，另外你的上清是指穿透峰吗？下面这个帖子可供你参考
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/550772')

• 米囡 (2013-7-31 17:26:30)

  不好意思，先作一说明：右起1、2、3、4条带分别为：蛋白Marker、破碎前上清、破碎后上清、过Ni柱后的上清；目的蛋白分子量14KDa，在图上最下位置的条带为目的蛋白条带，纯化还处于初步阶段，我是用离心方法得到的上清。另外，我作了WESTERN BLOT，已经证明表达了的目的蛋白。

• 30moonriver (2013-7-31 17:28:58)

  
  减少上样量，降低流速，增加介质与目的蛋白的接触时间，如果效果不好，可以适当的加一些非离子的表面活性剂如Triton x-100

• fei1226com (2013-7-31 17:29:24)

  
  如果洗脱中有目的蛋白，而上样穿透中也有，那么说明上样量太大，如果洗脱中没有，应该是没有结合上去，Q1:为什么没有洗脱的电泳条带？Q2:冒昧，目的蛋白是否是可以结合Ni柱的？

• 米囡 (2013-7-31 17:29:49)

  
  从电泳结果看上样穿透前后没有明显变化，表明上样穿透液中有目的蛋白；在洗脱液中没有见到目的条带，分析蛋白没有结合上去。但我之前做了抗His Western blot，结果表明目的蛋白带有His标签。我再减少上样量、加Triton x-100 试一试，谢谢各位！！

• DONT (2013-7-31 17:30:14)

  下次麻烦给电泳图作一说明，另外你的上清是指穿透峰吗？下面这个帖子可供你参考
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/550772')
  
  ========================
  
  请问 fruitsu 穿透峰 指什么东西？
  谢谢

• BUK (2013-7-31 17:30:48)

  
  在平衡缓冲液和样品中都不要加咪唑，降低流速0.5-1ml/min，这样再挂柱看看，或者可以参照我们以前的说法，直接把介质加到样品中，震荡2-3小时，直接用介质加loading buffer，煮5-10min跑电泳看有没有带，然后再在柱上分离。

• 米囡 (2013-7-31 17:31:08)

  
  我减少了上样量、加了Triton x-100 ,重新进行了一次纯化,但结果仍不好.我怀疑是Ni-NTA Agrose的问题,想问问高手,Ni-NTA Agrose有沉淀,加填料之前,需要把Ni-NTA Agrose混匀吗?

• mysmdbl (2013-7-31 17:32:12)

  
  我给你发了份详细的金属螯合层析的材料，你看看吧，会有帮助的，当然乙醇会有影响了，使用前先用水后用缓冲液平衡柱子，否则样品遇到乙醇如果有沉淀那就什么也做不出了，此外有机溶剂也许会对吸附不利，无论什么原因都需要平衡好柱子再上样。

• okhaha (2013-7-31 17:32:37)

  
  请问版主，镍柱遇到乙醇了还能再使用么？