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【求助】如果蛋白降解,我该怎么办?
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发表于: 2013-8-03 08:48 作者: JK.jon 来源: 分析测试百科网
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【求助】如果蛋白降解,我该怎么办?
如果蛋白降解,我该怎么办?还用重新从组织块中提取吗?我的组织很难找到的。谢谢!
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【求助】如果蛋白降解,我该怎么办?
我也来说两句
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最新回复
greenbee
(2013-8-03 08:49:06)
如果确信蛋白提取出来以后降解了,那替你惋惜,只能重新去提取
这时候你就要分析是什么原因造成了它的降解,是不是环境中存在的蛋白酶呢?
如果是的话,那下次再提取的时候就要在提取液中加入蛋白酶抑制剂,有几种,好像还有什么PMSF
试试看
JK.jon
(2013-8-03 08:50:27)
我的蛋白电泳昨天还是好好的,电泳结束以后有很漂亮的条带,一夜之间就全变了,在胶上只能见到涌到,其他什么带都都没有,包扩我新处理的蛋白,也不知道是为甚么,而且我提取时加入pmsf了,od直也测出来了呀,能帮帮我吗?不胜感激。
wsll
(2013-8-03 08:50:48)
我也遇到过这种事,不过没有这么严重,我的出现了很多杂带.
我是由于两次跑的胶浓度不同产生了不同的分离情况.
你的情况可能是降解了,这样OD值不会策不出来,但是却没有条带.
另外,你的蛋白如何保存?冻熔后有无沉淀产生?
再跑一次看看吧,然后再确定原因.
applebook=213
(2013-8-03 08:51:07)
我实验中也有遇到过这样的情况,当时我们重新配了上样buffer和丙稀酰胺后就好了。此外,样品保存也很重要,我通常是提取的蛋白质分装后一部分直接-70保存,一部分加buffer煮沸后-70保存,总不会两种条件下的东西都降解吧。
loli
(2013-8-03 08:52:09)
蛋白降解了还有用吗?只能重新提取了
one
(2013-8-03 08:53:10)
首先确定你提取的蛋白质是否降解了。如果是的话,我只能对你表示同情!
我说说我们提取蛋白质的一些情况,希望对你下一次再提取时有点帮助:
1.在提取蛋白质过程中最好连续,整个过程最好在4度下进行;在接触蛋白质的缓冲液或其他试剂中都加一点蛋白酶抑制剂(如PMSF等)防止蛋白质的降解,有时在透析液或其他溶液中也要加入抑菌试如叠氮钠)。
2.提取的蛋白质原液最好浓缩一下(我们用浓缩膜浓缩的),蛋白质在稀溶液中更容易降解。
3.在做完电泳、westblot、测定蛋白质的浓度后就及时分装保存。
4.直接的纯化的蛋白质溶液保存也相对容易降解,你可以采取蛋白质干粉可以-20度保存。
5.液态保存蛋白质时加甘油保护-20度也可以保存,如果你短时间不用,建议-70度保存备用。
最后祝你好运!
JK.jon
(2013-8-03 08:54:48)
因为我的蛋白样品天天用所以放在4度冰箱里,有一部分冻在-20但是动容后也没有沉淀产生,今天我重提了蛋白跑完的结果还是一样的没有带的。重新配制电泳缓冲液和丙稀酰胺后有点带了,但是也不像原来那么漂亮清楚了。上样buffer一直保存在4度,每次都用他调浓度,他对蛋白的影响会很大吗?
am10
(2013-8-03 08:55:44)
蛋白样品天天用,应该分装成小包装,在-20度保存,况且避免蛋白质的反复冻溶是保存的一个常识,不仅使其容易降解,也难以保证其蛋白质的生物活性。
各种试剂最好不要放置太长时间,因为起PH值等都会有所变化,影响电泳效果。
上样buffer当然可以在4度保存,我不明白你:“上样buffer一直保存在4度,每次都用他调浓度”是什么意思,上样buffer能调蛋白质浓度?(我们的聚丙稀酰胺凝胶电泳的上样2×buffer是这样的:1 mmol/M Tris-HCL ph6.8 2.5ML,β-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6克,甘油2.0ml,0.1%溴酚蓝1.0ml,双蒸水3.5ml)。
最后祝你好运!
wmp1234
(2013-8-03 08:56:04)
我保存蛋白一般都是先分装成20μl/EP管,保存在-70℃,用的时候就拿一管,这样蛋白就不容易降解了!希望对你能有所帮助:GOOD LUCK!
JK.jon
(2013-8-03 08:56:24)
如果我的蛋白一直保存在四度会有影想吗,我的上样buffer跟您的配方一样,用他调浓度就是说案1:5的关系加入蛋白中煮沸,然后上样,我是想问上样buffer时间长了会影响电泳吗?也许是因为我太急了,所以没有表达清楚。谢谢大家帮忙,祝愿所有做western的战友,明天都有好结果!
greenbee
(2013-8-03 08:56:57)
蛋白一直保存在四度肯定会有影响,容易降解,除非是蛋白质干粉可以这么放,不能反复冻溶..没有-70度的条件你把它分装后放置-20度冰箱不是很方便吗?就如楼上cmlbright 战友的方法,可以分装成小包装低温保存.用时拿一点出来就行了啊!我们电泳时,加等量的2×上样buffer,1:5恐怕不太合适,这个比例加上样buffer我们没做过.
JK.jon
(2013-8-03 08:58:18)
我的问题解决了,重新配了上样buffer和丙稀酰胺,跑的带好多了,谢谢大家热情相助!!!
babybabe
(2013-8-03 08:59:16)
降解多了,还是重新提蛋白吧
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我也来说两句
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【求助】如果蛋白降解,我该怎么办?
最新回复
greenbee (2013-8-03 08:49:06)
如果确信蛋白提取出来以后降解了,那替你惋惜,只能重新去提取
这时候你就要分析是什么原因造成了它的降解,是不是环境中存在的蛋白酶呢?
如果是的话,那下次再提取的时候就要在提取液中加入蛋白酶抑制剂,有几种,好像还有什么PMSF
试试看
JK.jon (2013-8-03 08:50:27)
wsll (2013-8-03 08:50:48)
我也遇到过这种事,不过没有这么严重,我的出现了很多杂带.
我是由于两次跑的胶浓度不同产生了不同的分离情况.
你的情况可能是降解了,这样OD值不会策不出来,但是却没有条带.
另外,你的蛋白如何保存?冻熔后有无沉淀产生?
再跑一次看看吧,然后再确定原因.
applebook=213 (2013-8-03 08:51:07)
我实验中也有遇到过这样的情况,当时我们重新配了上样buffer和丙稀酰胺后就好了。此外,样品保存也很重要,我通常是提取的蛋白质分装后一部分直接-70保存,一部分加buffer煮沸后-70保存,总不会两种条件下的东西都降解吧。
loli (2013-8-03 08:52:09)
one (2013-8-03 08:53:10)
我说说我们提取蛋白质的一些情况,希望对你下一次再提取时有点帮助:
1.在提取蛋白质过程中最好连续,整个过程最好在4度下进行;在接触蛋白质的缓冲液或其他试剂中都加一点蛋白酶抑制剂(如PMSF等)防止蛋白质的降解,有时在透析液或其他溶液中也要加入抑菌试如叠氮钠)。
2.提取的蛋白质原液最好浓缩一下(我们用浓缩膜浓缩的),蛋白质在稀溶液中更容易降解。
3.在做完电泳、westblot、测定蛋白质的浓度后就及时分装保存。
4.直接的纯化的蛋白质溶液保存也相对容易降解,你可以采取蛋白质干粉可以-20度保存。
5.液态保存蛋白质时加甘油保护-20度也可以保存,如果你短时间不用,建议-70度保存备用。
最后祝你好运!
JK.jon (2013-8-03 08:54:48)
因为我的蛋白样品天天用所以放在4度冰箱里,有一部分冻在-20但是动容后也没有沉淀产生,今天我重提了蛋白跑完的结果还是一样的没有带的。重新配制电泳缓冲液和丙稀酰胺后有点带了,但是也不像原来那么漂亮清楚了。上样buffer一直保存在4度,每次都用他调浓度,他对蛋白的影响会很大吗?
am10 (2013-8-03 08:55:44)
蛋白样品天天用,应该分装成小包装,在-20度保存,况且避免蛋白质的反复冻溶是保存的一个常识,不仅使其容易降解,也难以保证其蛋白质的生物活性。
各种试剂最好不要放置太长时间,因为起PH值等都会有所变化,影响电泳效果。
上样buffer当然可以在4度保存,我不明白你:“上样buffer一直保存在4度,每次都用他调浓度”是什么意思,上样buffer能调蛋白质浓度?(我们的聚丙稀酰胺凝胶电泳的上样2×buffer是这样的:1 mmol/M Tris-HCL ph6.8 2.5ML,β-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6克,甘油2.0ml,0.1%溴酚蓝1.0ml,双蒸水3.5ml)。
最后祝你好运!
wmp1234 (2013-8-03 08:56:04)
我保存蛋白一般都是先分装成20μl/EP管,保存在-70℃,用的时候就拿一管,这样蛋白就不容易降解了!希望对你能有所帮助:GOOD LUCK!
JK.jon (2013-8-03 08:56:24)
如果我的蛋白一直保存在四度会有影想吗,我的上样buffer跟您的配方一样,用他调浓度就是说案1:5的关系加入蛋白中煮沸,然后上样,我是想问上样buffer时间长了会影响电泳吗?也许是因为我太急了,所以没有表达清楚。谢谢大家帮忙,祝愿所有做western的战友,明天都有好结果!
greenbee (2013-8-03 08:56:57)
蛋白一直保存在四度肯定会有影响,容易降解,除非是蛋白质干粉可以这么放,不能反复冻溶..没有-70度的条件你把它分装后放置-20度冰箱不是很方便吗?就如楼上cmlbright 战友的方法,可以分装成小包装低温保存.用时拿一点出来就行了啊!我们电泳时,加等量的2×上样buffer,1:5恐怕不太合适,这个比例加上样buffer我们没做过.
JK.jon (2013-8-03 08:58:18)
babybabe (2013-8-03 08:59:16)
降解多了,还是重新提蛋白吧
【求助】如果蛋白降解,我该怎么办?