【求助】做WESTERN时，蛋白浓度已经知道了，蛋白上样...

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-8-03 10:32 作者: qiangren789 来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】做WESTERN时，蛋白浓度已经知道了，蛋白上样...

我是新手才开始做WB

最近提了蛋白用BCA法定量提了两组蛋白一组是3.22ug/ul，另一组是2.44ug/ul

我看了很多帖子说要把浓度调为等浓度的

那么我应该怎么调呢~谢谢各位老师了~~

查看完整版本请点击这里：
【求助】做WESTERN时，蛋白浓度已经知道了，蛋白上样...

我也来说两句查看全部回复

最新回复

uuooii (2013-8-03 10:32:49)

把3.22的浓度调整成2.44，然后上样量保证一样即可！
uuooii (2013-8-03 10:33:34)

把3.22的浓度调整成2.44，然后上样量保证一样即可！具体公式：假设你现在体积是A，那么：（A+X)*2.44=A*3.22，X就是要加入的体积！
qiangren789 (2013-8-03 10:34:40)

还有就是将浓度调为一致的后要上样本的体积是应该一样么？不足的以双蒸水补足哇？
uuooii (2013-8-03 10:35:27)

QUOTE:
原帖由 qiangren789 于 2013-8-3 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

还有就是将浓度调为一致的后要上样本的体积是应该一样么？不足的以双蒸水补足哇？
浓度一样，上样量体积一样，其中所含蛋白不就一样吗？
lgm (2013-8-03 10:36:04)

用裂解液稀释成一样的浓度啊……等量上样
Ao7 (2013-8-03 10:37:02)

浓度不用调，上一样的蛋白总量就好，如都上35ug
qiangren789 (2013-8-03 10:38:15)

浓度不用调，上一样的蛋白总量就好，如都上35ug

==================================

我迷茫了~~

我的是小鼠的肺组织~

你意思是体积不用一样高浓度的多加裂解液么
lixi559 (2013-8-03 10:38:51)

浓度不用调，上一样的蛋白总量就好，如都上35ug

===========================================================================================================

对，不用调浓度，上样的总蛋白量一样就好。具体上样量还要看你杂什么蛋白，一般看家基因的20-40 ng 就差不多了，为了节省蛋白和准确性，你可以先试试上20或者25 ng。因为标样蛋白跟目的蛋白的空间结构不一样，所以BCA测可能有误差，先根据BCA浓度做个预杂交看看条带怎么样，如果明显不一致，最好找个WB高手帮忙微调一下。看家基因的蛋白调一致了，再根据要杂的目的蛋白的情况翻倍上样，一般翻一倍吧，难杂的就要再摸索一下了。
lixi559 (2013-8-03 10:39:15)

对，不用调浓度，上样的总蛋白量一样就好。具体上样量还要看你杂什么蛋白，一般看家基因的20-40 ng 就差不多了，为了节省蛋白和准确性，你可以先试试上20或者25 ng。因为标样蛋白跟目的蛋白的空间结构不一样，所以BCA测可能有误差，先根据BCA浓度做个预杂交看看条带怎么样，如果明显不一致，最好找个WB高手帮忙微调一下。看家基因的蛋白调一致了，再根据要杂的目的蛋白的情况翻倍上样，一般翻一倍吧，难杂的就要再摸索一下了。

====================

不好意，"ug"写成了"ng"
kswl870 (2013-8-03 10:41:23)

你就是定好每个泳道上多少ug的蛋白量啊，比如定为每个泳道上样20ug，那个浓度为是2.44ug/ul上样的总蛋白量为48.8ug，那么 3.22ug/ul的上样就应该是15ul，不足的用1X的buffer加5ul既可以了。
qiangren789 (2013-8-03 10:43:17)

谢谢我也问了实验室的师姐也是说的调成等量的就好~
DDD (2013-8-03 10:43:52)

看个人习惯吧，可以调也可以不用调，最终保证上样质量一样就可以了。

但是如果不调的话，相邻泳道的上样体积最好不要相差太大，否则结果可能出现上样体积大的泳道条带宽，而旁边泳道窄的现象。