【求助】WB10KD 做的快吐血了

最新回复

• 101010 (2013-8-03 11:19:16)

  
  tricine-SDS-PAGE要延长转膜时间，你可能是电泳没跑好，电泳试剂重新配呗

• 市井小民 (2013-8-03 11:19:37)

  延长？我的是100v 30min 还要多久啊！东西是新配滴!

• 33号 (2013-8-03 11:19:54)

  
  没怎么看得懂啊，到底您的SDS-PAGE跑出来没有？如果是这个都没跑好怎么就做的WB，这不是浪费精力吗？先做好page。同时你的样品是你自己做出来的，样品确定没有问题？总之我觉得老兄您说的不太清楚，想帮助您的同志也没法给你确切的建议！

• 市井小民 (2013-8-03 11:20:14)

  呃……我是先做的SDS-PAGE，是做出来滴！只是目的带是连着，后来查了很多都说小分子应该用tricine-SDS-PAGE，现在改用tricine-SDS-PAGE但是背景很深能模糊的看见带，貌似还是连着滴！我这样说不知道我说明白没的。

• 079777chao (2013-8-03 11:20:37)

  
  怎么搞的啊tricine-SDS-PAGE 2KD的都能跑出来的

  
  66258932.jpg

• yjf1026 (2013-8-03 11:21:14)

  兄弟，你用的是百分之十几的胶？ 你应该把你的胶配方带上，大家也好帮你分析啊。
  另外你的转膜时间确实短了，100V的话至少得1小时

• 市井小民 (2013-8-03 11:21:38)

  Separating Gel (14%)
  1块胶
  
  WG
  1.88ml
  
  30% Gel.sol
  2.8ml
  
  3M TrisHCl pH 8.45
  2 ml
  
  10% SDS
  0.06 ml
  
  10%APS
  0.06 ml
  
  TEMED
  0.003 ml
  
  Total
  6.003 ml
  
  
  间隙胶配方： 10%
  
  Spacer Gel (10%)
  1块胶
  
  dH2O
  0.47 ml
  
  30％ Gel.sol
  0.5 ml
  
  3M TrisHCl pH 8.45
  0.5 ml
  
  10% SDS
  0.015 ml
  
  10%APS
  0.015 ml
  
  TEMED
  0.0015 ml
  
  Total
  1.5015 ml
  
  
  浓缩胶配方：4%
  
  Stacking Gel (4%)
  1块胶
  
  2×Stacking. buffer
  1.5ml
  
  30％ Gel.sol
  0.75ml
  
  ddH2O
  0.75ml
  
  TEMED
  4ul
  
  10%APS
  40ul
  
  Total
  3.44mL
  这是配方不知道大伙能看明白不

• yjf1026 (2013-8-03 11:21:58)

  
  凝胶配方我没看出有什么问题，不知道其他兄弟能看出来不。 其实你要10KD的话，用SDS-PAGE 15%的胶,100KD的蛋白Marker，应该就能跑出来的，这样操作会比较简单，等跑出条带再做后面的步骤吧，要不浪费时间跟精力啊

• 市井小民 (2013-8-03 11:22:22)

  
  SDS-PAGE 已经做出来了，只是条带是连着的。

• 市井小民 (2013-8-03 11:22:59)

  
  过了这久后，我还是回来求助了。不管用SDS-PAGE 还是tricine-SDS-PAGE 实际上已经做出来过，但条带不是好看的那种好好的修修是可以用的了。但老板希望再漂亮，不知道是带着压力做怎么的，重复性很不好。老板又开始怀疑了，我确实有点受不了了。我就想问SDF-1的蛋白真的很难?重复性很差？条带背景深？

• KGZ564 (2013-8-03 11:24:04)

  
  减少上样量试试吧

• idea2011 (2013-8-03 11:24:22)

  
  我觉得吧，你至少也要15%的胶跑 转一般45min到1h就可以了。在就是用。22的膜，加大上样量。

• owanaka (2013-8-03 11:24:40)

  
  15%的胶来跑 一定得等marker 出了5 之后才能停电泳 你是用的湿转？ 我觉得小分子量的半干转好些 15v 30min就OK了

• yueban-1147 (2013-8-03 11:24:58)

  
  减少上样量试试~~

• www.1 (2013-8-03 11:25:20)

  
  条带连着我也觉得上样量太大了。如果非要这么大上样量才能杂交出来，那也只能这么做了吧

• 市井小民 (2013-8-03 11:25:47)

  eBioscience这个公司的抗体怎么样啊！最近10KD的一直出不来，抗体刚买回来的时候能做出来。可过了两个月就再也做不出来了。抗体是在4°保存的，以前1：500能做出，现在1：250都是空白的。

• bring (2013-8-03 11:26:07)

  
  不知道7kd的15%的胶能不能跑出来

• H2O (2013-8-03 11:26:23)

  
  抗体为什么要放4℃保存？应该放-20℃吧。

• 市井小民 (2013-8-03 11:26:44)

  
  说明书上是这样说的啊！我记得放-20的都是加了甘油的吧！