【求助】怎样提高细胞总蛋白提取浓度，求提细胞总蛋白...

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• tangxin_80 (2013-8-10 09:34:32)

  你还要看你的细胞有多少，75mm2培养皿的细胞融合约90%时，我是用200μl的裂解液加磷酸酶抑制剂2μl，100mM氟化钠2μl,100mM原钒酸钠2μl，100mM PMSF2μl.冰上裂解30min，再12000g离心5min，取上清，测出来的蛋白深度一般是6.0μg/μl。
  组织蛋白就要先在匀浆机匀浆后离心再取上清就行，其他的一样。

• mogu (2013-8-10 09:35:05)

  QUOTE:

  原帖由 tangxin_80 于 2013-8-10 09:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你还要看你的细胞有多少，75mm2培养皿的细胞融合约90%时，我是用200μl的裂解液加磷酸酶抑制剂2μl，100mM氟化钠2μl,100mM原钒酸钠2μl，100mM PMSF2μl.冰上裂解30min，再12000g离心5min，取上清，测出来的蛋白深度一般是6.0μg/ ...

  哇塞，提出来浓度这么高。。我能达1ug/ul就好了！！

• mogu (2013-8-10 09:40:50)

  QUOTE:

  原帖由 tangxin_80 于 2013-8-10 09:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你还要看你的细胞有多少，75mm2培养皿的细胞融合约90%时，我是用200μl的裂解液加磷酸酶抑制剂2μl，100mM氟化钠2μl,100mM原钒酸钠2μl，100mM PMSF2μl.冰上裂解30min，再12000g离心5min，取上清，测出来的蛋白深度一般是6.0μg/ ...

  大侠，75mm才加200ml的ripa啊？我25mm2的培养基都加了500ul。。。。55555，都还裂解不出来

• cwcwcww (2013-8-10 09:43:27)

  
  你收集的细胞为多少，一般根据你收集细胞的体积来加裂解液，一般裂解液的体积为细胞体积的5倍左右，浓度再2-5ug/ul是没问题的。

• mogu (2013-8-10 09:43:56)

  QUOTE:

  原帖由 cwcwcww 于 2013-8-10 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你收集的细胞为多少，一般根据你收集细胞的体积来加裂解液，一般裂解液的体积为细胞体积的5倍左右，浓度再2-5ug/ul是没问题的。

  谢谢大侠，我想再问问，需要冻融三次不？

• mogu (2013-8-10 09:44:21)

  组织的话，与裂解液加的比例也是这样么？

• cwcwcww (2013-8-10 09:44:43)

  我提取细胞未反复冻容，直接就加的裂解液（含PMSF）的。组织的你可以适当提高，因为组织的蛋白含量会比细胞高很多，一般的比例是100mg组织加入1ml的裂解液。但是组织的均浆很重要，匀浆的同时还需在冰上进行
  

• JK.jon (2013-8-10 09:45:11)

  我一瓶细胞加100ul左右，加太多会不会蛋白浓度会很低啊？