0.5% Triton X-100 代替 1％NP40，
When incubate with your Tag antibody, Please dilute Triton to 0.2% with lysis buffer not containing detergent. room temperature incubation 1h, wash with lysis buffer then move to three times washing by PBS.
Run gel-----> Good result!
Good luck
我认为没必要用不同NaCl浓度的lysis buffer裂解，50mM~150mM都可以。保证裂解完全。检查抑制剂质量和正确用法。
条带边界锯齿状是由于DNA和detergent的原因。可以超声5s或用3~5x loading buffer，或者在裂解液中加dnase.
Replace DTT with bMe.
不要用高于300mM的盐洗。
检查抗体来源，注意protein A and protein G have different binding specificity. 我们只用amersham的protein G.
还可以试不同公司的抗体，不是每一个抗体都好用 （对IP来说）。
最新回复
woshiduiyan (2013-8-10 11:24:54)
外源质粒转染HeLa细胞后，提取细胞总蛋白。但是好像在提取这一步就做得不是很好，我用的裂解液成份是50mMTirs-Cl,150mM NaCl,1%NP40+Aprotinin+PMSF
98776langtao (2013-8-10 11:25:13)
0.5% Triton X-100 代替 1％NP40，
When incubate with your Tag antibody, Please dilute Triton to 0.2% with lysis buffer not containing detergent. room temperature incubation 1h, wash with lysis buffer then move to three times washing by PBS.
Run gel-----> Good result!
Good luck
woshiduiyan (2013-8-10 11:25:35)
不知道如果加上超声波破碎细胞，提取的蛋白含量会不会高，请问超声破碎的具体条件是怎么样？哪里能查到？
woshiduiyan (2013-8-10 11:26:29)
lgm (2013-8-10 11:27:00)
一般情况要Preclearing和4度incubation。
在洗的时候注意选择离子强度
xingyi08 (2013-8-10 11:27:19)
不知道有谁做过用外源基因在哺乳动物细胞内表达，然后利用标签作CO－IP的，能具体交流吗？我现在的实验面临瓶颈，又急着要实验结果毕业，心急！
xingyi08 (2013-8-10 11:28:38)
由于在摸索条件的阶段，所以用T＋p53这对阳性对照做试验。
T＋p53两种质粒转入细胞后，48h后收获，加不同NaCl浓度的lysis buffer裂解。
遇到的困难：
1.提取的蛋白浓度过低。
2.直接用总蛋白SDS—PAGE电泳后，考染发现，条带边界锯齿状，还原上样缓冲液与非还原上样缓冲液之间蛋白条带数没有差别，且上样后电泳的溴芬兰跑得特难看。
3.用提取的蛋白CO－IP，参考的是Roche公司的操作手册，因为我们用的protei A－agarose 是Roche的；洗涤后做WB，发现目的条带若有若无，非常的弱，且实验非常不稳定，重复的两次实验之间结果都不同。后来从60mm平皿改用100mm平皿养细胞，加大细胞的量，结果都没有出来。
转眼一个月又一个月过去，实验条件改了很多，还是毫无进展，实在是汗颜，现请各位指点一二。先谢了^_^
standbyme (2013-8-10 11:28:58)
我认为没必要用不同NaCl浓度的lysis buffer裂解，50mM~150mM都可以。保证裂解完全。检查抑制剂质量和正确用法。
条带边界锯齿状是由于DNA和detergent的原因。可以超声5s或用3~5x loading buffer，或者在裂解液中加dnase.
Replace DTT with bMe.
不要用高于300mM的盐洗。
检查抗体来源，注意protein A and protein G have different binding specificity. 我们只用amersham的protein G.
还可以试不同公司的抗体，不是每一个抗体都好用 （对IP来说）。
DDD (2013-8-10 11:29:22)
detergent只有一种NP40，而且是1％的，对电泳的影响这么大？我破壁就是用超声，加的也是5×loading buffer，以前是用b－ME的，但是效果也不理想，所以才重新配，换成DTT。
你所说的抗体的两个问题我都注意到了，我们是换了不同的抗体实验的。protein A的适应范围确实没有G广，但是我们的抗体都是针对A买的，问题应该不是太大，
standbyme (2013-8-10 11:30:30)
你有直接细胞裂解的对照吗？western的带强吗？
你用的是RIPA? 用得着再超生吗？
我所说的3~5x loading buffer是指最终浓度。
你用的抗体是什么？
vera+ (2013-8-10 11:30:49)
我说一下co-ip的注意事项把：
1，它只能研究在细胞溶胶中的蛋白质相互作用；
2，必须有proper control;
3,不能检测暂时的相互作用；
4，不能检测不容的生物大分子间的相互作用；
zwsyrt (2013-8-10 11:31:06)
你好jacky010:能具体介绍下这个技术吗？最近要做，可是没有人做过，不知道实验的那个环节要注意什么？
【讨论帖】请教CO－IP的经验！