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【求助】再论120KD蛋白的转膜条件及相关影响因素
本人最近做WB,目的蛋白NCX-1---120KD,胶用考马斯亮蓝染色,120KD处有条带(虽然不一定是我的目的蛋白)而转膜后一直没条带(指转膜后立春红染色),各种转膜条件试了不少,如200MA,3-4小时,30-40V过夜(国产机子),但都没 条带.NC膜(0.44微米),而我的内参:beta-actin 200MA,2小时,效果很好【求助】再论120KD蛋白的转膜条件及相关影响因素
转膜缓冲液配方:转移缓冲液 甘氨酸(MW75.07) 2.9g
Tris(MW121.14) 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
大家,给点建议?调节SDS与甲醇的比例?,请大家指点迷津,谢谢!
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【求助】再论120KD蛋白的转膜条件及相关影响因素
最新回复
purrr (2013-8-10 13:45:18)
uuooii (2013-8-10 16:24:46)
谢谢,我做过很多次,用化学曝光发,都没条带,上样量是梯度:100,130,150,180,200,230微克。因为抗体是新买的,美国ABR公司的,所以一直怀疑是转膜步出差错了,因为二抗,为公用,内参有结果,二抗没问题
purrr (2013-8-10 16:25:15)
这样子啊,做个dot blotting看看。或是提高一抗浓度。
uuooii (2013-8-10 16:25:47)
uuooii (2013-8-10 16:26:09)
有点杂交的操作步骤吗?在膜上加提的原始蛋白呢?(指没加Loading buffer)还是加后的上样蛋白?具体说一下好吗?我听说过做点杂交,但具体没做过,抗体是新的,美国ABR公司的,谢谢
am10 (2013-8-10 16:27:01)
uuooii (2013-8-10 16:27:18)
purrr (2013-8-10 16:27:37)
uuooii (2013-8-10 16:28:34)
本人最近做WB,目的蛋白NCX-1---120KD,胶用考马斯亮蓝染色,120KD处有条带(虽然不一定是我的目的蛋白)而转膜后一直没条带(指转膜后立春红染色),各种转膜条件试了不少,如200MA,3-4小时,30-40V过夜(国产机子),但都没 条带.NC膜(0.44微米),而我的内参:beta-actin 200MA,2小时,效果很好
转膜缓冲液配方:转移缓冲液 甘氨酸(MW75.07) 2.9g
Tris(MW121.14) 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
大家,给点建议?调节SDS与甲醇的比例?,请大家指点迷津,谢谢!
希望大家给于帮助,谢谢!
is2011 (2013-8-10 16:28:57)
200mA 3-4小时,转膜后丽春红染不出,可能是转膜过了。
我今天就在做120kDa的蛋白,200mA转膜60min条带稍微淡一点点,90min和120min几乎没差别。
windy+++ (2013-8-10 16:31:31)
我今天就在做120kDa的蛋白,200mA转膜60min条带稍微淡一点点,90min和120min几乎没差别。
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我做过110KD的,用350MA,70分钟,效果可以,丽春红可以看出条带。不过我上样是50ug.
3N4G (2013-8-10 16:38:34)
langlang (2013-8-10 16:38:56)
是不是转过了啊,200mA,2.5h试试。
【求助】再论120KD蛋白的转膜条件及相关影响因素