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【求助】同时跑6块胶的结果及问题
6块胶除了银染染色部分其他全部同时做的。银染时是两块胶同时染的。、【求助】同时跑6块胶的结果及问题
问题：wt3和ko3的中上部很明显有一些蛋白没有聚焦完全，这可以对比其他几块胶发现，wt3和ko3不是同时银染的。为什么会出现6根胶条聚焦情况不一样的情况呢？难道是上样的时候定量不准确？除此之外还有其他可能性么？
再求一些建议和指点，哪里还需要改进。
谢谢~~
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【求助】同时跑6块胶的结果及问题
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最新回复
ladyhuahua (2013-8-13 17:42:29)
LZ,我遇到的问题跟你一样。。。同时跑三块胶，总有那么一两块胶聚焦不完全，不懂啊
kuohao17 (2013-8-13 17:42:52)
这就是双向电泳了，同批次跑的尽量保证是一个样品（而不是WT/KO）.
she (2013-8-13 17:43:21)
QUOTE:
我觉得这样不好吧……要尽量同时做才好啊wmp1234 (2013-8-13 17:43:40)
楼主的wt1，2，3（ko1，2，3）是同一管样品上样3根胶条吗？还是3个平行的样品呢？
多长的胶条啊？24cm？
she (2013-8-13 17:44:06)
QUOTE:
3个平行样品。17cm的wmp1234 (2013-8-13 17:45:00)
我觉得你可以试着做同一个样品跑3根胶条，这样结果图也不一定会完全一样，也许也会差比较多哦，更何况是3个平行样品呢。要知道虽说是平行样品，也还是存在差异的啊，这个是一定的。你那个说聚焦不好的，我觉得这就是样品间的差异问题了。
(*^__^*) 嘻嘻……，希望可以帮到你
she (2013-8-13 17:46:00)
不同样品，同种处理方式，样品性质之间差异导致聚焦的差异。最好还是同种样品一起跑，不同样品很难说是谁影响谁的聚焦。
如果实在要不同样品一起跑，应该保证足够的聚焦时间使所有样品聚焦充分。最重要要保证两种样品干扰物质（盐离子）浓度处于低水平，即对聚焦不产生影响。不知楼主样品处理方式是怎样的？最终的样品可以一起用2D clean up kit处理，这样平行性会好的。
个人浅见，仅供参考！
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是不同处理的三个平行样品之一。wt3和ko3不是一起染的，所以会出现背景差异了吧……
你是说同一个样品做3个平行么？样品制备的话就是用的BioRad的总蛋白提取试剂盒。没有做过clean up处理。问题是其他几块都好好的，就wt3和ko3有聚焦不完全的现象。
she (2013-8-13 17:46:19)
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但我觉得同一个样品跑三根胶条，这样的话处理前后的差异没有统计学意义了啊……也许你用的跑三根胶条的样品是个特例不就囧了么wmp1234 (2013-8-13 17:46:55)
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嗯，道理是这样没有错，可是你也知道双向的重复性本来就不是很好，按照你的说法，我认为，首先，wt组应该提取3个蛋白平行样，然后每个平行样跑3块胶，然后找最为相似的3幅图。ko组一样的处理方式，然后做比较。这样不是工作量相当大吗？我跑过13cm的，同一管样品上样3根同时跑，最后结果也出现了很大的差异，所以说双向这个东西是很微妙的，呵呵。
过几天我要做24cm的了，比较实验的设计是和你一样的，到时候看结果吧，我估计也会出事，到时候要请教你怎么解决了~~~~~~~呵呵
she (2013-8-13 17:47:32)
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我看文献里都是取不同样品的平行的。没看到过有用一个样品重复的……junhun (2013-8-13 17:48:08)
我也遇到过像你这样的问题，就是三个不同组的样本一起跑，结果有的聚焦好，有的聚焦不好，现在我也不知是什么原因，我就一根一根的跑，最后跑二向的时候，再同时跑。不过我很赞成楼上说的，若是几根同时跑的话，只要保证充分的聚焦条件，还是可以一起跑的，我这次就是延长了聚焦时间，结果还可以，下次准备三根一起跑了，一根一根也太慢了，呵呵
she (2013-8-13 17:48:29)
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你一起跑的条件是怎样的？和单独跑的有什么改动么？wawa (2013-8-13 17:48:48)
你可以试试用酒精将电极板和跑一维电泳槽与电极板接触的金属片擦一擦，晾干再做一维电泳，有时电极板与金属片接触不好也可能聚焦不完全
she (2013-8-13 17:49:51)
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用的是GE的系统，没有金属片……junhun (2013-8-13 17:50:31)
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我单独跑的时候帮除盐的低电压时间延长了，不过从结果来看，还是不错的，比三根在一起跑的要好的多，不过三根在一起跑的时候，也有可能是除盐时间不够，所以聚的不好！下次我就准备三根一起跑了，充分延长低电压时间，应该问题不大了，我下次就来试。wood533 (2013-8-13 17:52:06)
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一根一根跑一向，再一起做二向，那做完一向的胶条怎么保存哦？
junhun (2013-8-13 17:52:35)
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将聚焦好的胶条放进-20度以后就可以了，临用时10分钟左右的解冻时间就OK 啦，我都是这么做的。
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