【求助】请教SDS-PAGE胶的问题

最新回复

• 68943512yao (2013-8-14 15:39:53)

  
  本人遇到过类似的现象。
  第一，胶凝时间与催化剂（也就是APS和TEMED）的量有关，也与气温有关。像现在这样的天气应该是凝得比较快的。这两个东东也不能加得太多了，比例要协调。5％的胶是有点凝得慢。催化剂可比分子克隆上的多加20％左右。你的试剂有无问题？APS低温保存不能超过一周，我一般只用四天就换新的。TEMED有无注意冷藏好避光？再者就是加入这两个东东后要尽量混匀，不然也凝不好。
  第二，梳子一定要洗干净！用干净海绵蘸洗洁精反复擦试，冲洗，双蒸水荡洗，晾干后使用。因为不干净的梳子可使表面张力降低，将加样孔之间的尚未凝的胶排开，无法得到好的孔。当然包括制胶的平板（玻璃板和瓷板）都要洗干净。此外，插梳子的时候宜稍稍将一端倾斜，不要弄起泡沫。放平。插好后最好不要搬动。其实这并不是胶的回缩现象，因为如果是回缩的话，应该是整个积层胶而不是某一部分胶缩下去。
  其实即使如此，仍然是可以补救的。将制胶后剩余的积层胶置冰箱中（这样就可凝得慢些），如看到胶有回缩现象，可沿梳子上部以枪头滴加使之往下流入孔中，填补加样孔之间的空隙。这样做一般不影响电泳效果。
  第三，提醒一下，有时候完全照搬书上的东东可能得不到你期望的结果。实验条件是可以摸索，也是可以修改的。尝试作一些微小的变动。不要死心眼认为书上说的就一定好。
  祝你成功！有什么问题可以交流。

• biabiade (2013-8-14 15:40:25)

  
  APS是我星期三配的，TEMED也是分装在棕色瓶中存于4度的。每次配胶加这两样时都注意混匀了。而且每次10%的分离胶就凝的很好，一般45分钟左右都能凝，偏偏5%的浓缩胶就不行，如果试剂有问题，那分离胶也不会凝的啊。
  我们老师对我都没信心了。
  温度高胶就凝的快吗？
  

• 68943512yao (2013-8-14 15:41:08)

  
  如果只是浓缩胶凝得不好，我想试剂应该不会有什么大问题。不过还是应该注意过硫酸铵低温保存不超过一星期，我是每次要用之前现配200 ul。
  胶凝固以后会缩回一些，不过应该不会太多，我一般都会在插了梳子以后再稍微加一些，反正多加一些只要不会流下来就可以了，胶凝好了以后样品孔也还不错。
  如果胶凝好了以后短了一大截，你最好检查一下有没有什么地方漏液，前天我们这里一个师兄做连续胶，做完以后样品孔都快没了，做了两次都是样品孔短一截，最后发现是玻璃板上有个地方有点破、漏液，漏得不明显，只是把槽拿起来会看见槽的脚底有一点点水印。换了块好板子就没有问题了。
  如果没发现板子破了或其他明显可见的漏液的地方，那你看看梳子是否和板子的厚度配套。我上个学期有一段时间跑电泳，胶老是做不好，而且分离胶周围有裙边，后来发现板子因为用的人多把规格搞混了，板子是0.75 mm厚的，梳子是1.0 mm厚的，而1.0 mm的板子不知给谁换走了，从新买了两块1.0 mm厚的就没问题了。因为这两种规格的玻璃板很难看得出差别，而且1.0 mm的梳子也都能插得进去，所以是很难发现的，后来我们实验室的人又有做胶做好几次都做不好的，我帮检查了以后发现是同样的原因。

• 7437654 (2013-8-14 15:42:05)

  
  37度培养箱里，会加快凝的速度，半小时够了

• yychen (2013-8-14 15:43:01)

  温度高当然凝的快了。
  估计你不是漏胶的问题，因为要漏就不是一点点了，肯定是一大截。
  按我上述方法做以后应该不会出现那个回缩的问题了。
  先试试吧。
  按你所述，催化试剂的问题也不大。为排除试剂的问题，如以上战友所说，7可将剩余的积层胶置37度水浴或烘箱中，看是否凝得快？如果可以，那就只能考虑丙烯酰胺的问题了。而且我觉得你的分离胶凝得有些慢，我平常做8％的分离胶，大概只要25分钟左右就已经凝得非常好了，而你要45分钟。所以得考虑一下丙烯酰胺的问题。是进口的原料吗？丙烯和甲叉的比例是没有错的吧？先试着找一下原因吧。
  我的QQ：20378467 晚上在，可聊。最好晚点，呵呵。
  

• 68943512yao (2013-8-14 15:43:38)

  
  先要谢谢各位的回复。
  我配10ml分离胶，配方是：
  水 4.0ml
  30％丙烯/甲叉 3.3ml
  1.5M Tris（pH8.8） 2.5ml
  10％SDS 0.1ml
  10％APS 0.15ml
  TEMED 0.007ml
  
  配5ml浓缩胶， 配方是：
  水 3.4ml
  30％丙烯/甲叉 0.83ml
  1M Tris（pH6.8） 0.63ml
  10％SDS 0.05ml
  10％APS 0.06ml
  TEMED 0.007ml
  
  30％丙烯/甲叉是2.9g丙烯＋0.1g 甲叉定容至10ml。
  10％APS是0.1g定容至1ml
  
  您看这配方有误吗

• ending (2013-8-14 15:44:26)

  
  我的想法是:1,要检查一下30%丙稀酰胺,配方是否正确,时间久了不好,最好做抽滤,1,配胶缓冲液的配置是否正确,尤其是PH;3,聚合剂AP要是新配置的,10%AP配置好4度最多2周,再用就不放心了,尤其现在天热.个人感觉是丙稀酰胺的问题

• taoshengyijiu (2013-8-14 15:45:13)

  
  我现在配胶总是嫌它凝固太快。你的胶怎么会凝的慢？我在配好了分离胶后，封水。过了5分钟就发现有分界线了。曾经仔细观察过一次，大概2-3分钟就可以看到分界线了。
  
  真正郁闷。
  
  你的配方是10%分离胶，5%浓缩胶的分子克隆版配方。只是10%AP和TEMED都加量了。30%贮液必须定容，10%AP不必定容。你配的没错。
  
  其实，胶的凝固时间除了与温度有关外，与PH 值也有很大关系。我建议你重新配制浓缩胶BUFFER；并检查10%SDS的PH 值。有可能只是SDS 出了问题。你的催化剂和加速剂不用过量的。按照分子克隆已经是够多的了。现在是夏天啊。

• tie8 (2013-8-14 15:53:29)

  
  配方应是没错的。我的只是在分离胶中加的APS比你的配方要少一半。明胶加多少？
  与楼上有同感，现在这样的天气凝得很快的。有时我会把催化剂少加一点。
  SDS一般是很少出问题的。我一瓶东东用了一年多了，呵呵。
  可重配点丙烯酰胺，排除一下这方面的问题。
  按楼上所说，是得注意一下积层胶的buffer了。
  先试了再说吧。其实现在最主要的是看你做的东东能不能出条带？

• biabiade (2013-8-14 15:53:50)

  
  楼上提到的“积层胶的buffer”指的是什么啊？
  为什么要加明胶呢？
  “10%APS不必定容”，那就是说如果配1ml，可以是0.1gAPS+1ml水了？

• xingyi08 (2013-8-14 15:54:10)

  
  我是刚刚做SDS-PAGE电泳.请问我的指示剂总是跑成一团,而不是一条直线.

• 33号 (2013-8-14 15:55:03)

  我想问一下，我的标准蛋白为六条带，我做了几个月了都是四条或五条带，就是不能出现六条。我的标准为2512-16900的。我看书中说用C=10，还加8M Urea都试过了，都不行。我发现我电泳的时候出现C=3.3的能出现5条带，而C=10的就只有4条。

• wu11998866 (2013-8-14 15:55:38)

  
  郁闷极了，我的胶配的是越来越不好了，当然跑出来的带更不好，根本就不能分出几条带
  
  1、胶凝的慢极了，过夜20个小时也只是凝了胶孔以下的，也是齿梳那块不行，像是回缩，因为齿梳那块没有胶液了，桌子上也没有漏液。我自己分析的原因可能是我的过硫酸铵和TEMED加多了，800和80ul分别。
  
  2、配了两块胶出现同样的问题，应该不是漏
  
  3、过硫酸铵也是新的，temed也是新的，我也是新手