【求助】请大家帮忙看下我的2D图都存在哪些问题？

最新回复

• kulee (2013-8-17 15:42:30)

  
  换成大图

  
  89082785.jpg

• kulee (2013-8-17 15:43:29)

  另外请教大家，就这张图来看，如果换成GE 11cm pH3-10 非线性胶条，蛋白点可否分开？与伯乐17cm pH3-10 非线性胶条相比，哪个更合适？
  
  该实验接下来要做Western blot,这样来说上述两种胶条哪种更好？谢谢！

• jujuba (2013-8-17 15:43:54)

  你的实验总体来说应该这样改进：样品除盐（可考虑clean up）；降低上样量，250-300ug；换成4-7胶条；银染；用低熔点琼脂糖封胶。二向可能还有点别的问题（比如说平衡，这个有点微妙），先把上面提到的问题改了再看。

• kulee (2013-8-17 15:44:35)

  我的样品在上样前已经TCA-丙酮沉淀处理，只是所用试剂均为国产分析纯；由于没有测定蛋白浓度，上样量确实过大，这个稍后会做调整；如果改为非线性17cm胶体会怎样？碱性端蛋白不多但存在，我们的目的是要所有蛋白；请问琼脂糖封胶液和浓缩胶区别很大吗？最先也是用琼脂糖封胶，但总是气泡还没完全赶出就凝了，每次都费很长时间，也是在园子里看到园友用浓缩胶的，所以就换了。IEF结束后经两次平衡，10ml+0.2g DTT，15min，10ml+0.25g 碘乙酰胺，15min，后经电泳缓冲液漂洗后转至PAGE胶上。
  再次深深感谢！

• jujuba (2013-8-17 15:47:54)

• kulee (2013-8-17 15:48:21)

  非常感谢！
  最近买了一包伯乐的胶条，17cm，非线性，蛋白先经TCA-丙酮沉淀，聚焦程序同上，二向采用横流电泳，胶体染色法染色，结果如下，请前辈们给出改进意见，谢谢！
  
  [ 本帖最后由 kulee 于 2013-8-17 15:49 编辑 ]

  
  45142184.snap.jpg

• vivian4123 (2013-8-17 15:49:49)

  你的图整体上看上去不干净，请问你做的是什么组织，我跑的是肺组织。

• kulee (2013-8-17 15:50:18)

  我在灌胶时两端漏胶了，我觉得左面那些纹纹应该是漏胶导致的，还有就是脱色时间短，主要问题大分子量的蛋白条纹太多，没有分开，总是这样，很苦恼啊！

• 9900 (2013-8-17 15:50:41)

  
  请问一下，你的mark是怎么上样跑的啊？我的mark总是跑得不好，郁闷~

• vivian4123 (2013-8-17 15:51:07)

  
  我觉得你的条纹和漏胶的关系不是很大，主要还是在与样本的制备中的问题。现在图跑的怎么样了？

• kulee (2013-8-17 15:51:45)

  
  感觉还不理想，Marker加的也不好。请高手帮忙提些建议，谢啦！

  
  11849010.jpg

• vivian4123 (2013-8-17 15:52:03)

  
  今天有看到你的这个图，我提几点建议，不对的地方，再继续讨论吧1，你的聚焦程序不知改进了没？若是按照以前发的那个，除盐和升压的时间太短了，需要加倍延长，这个你得根据自己的上样量来摸下；2，上面这张图点了marker没？我好像看不到什么条带，若是点了的话，那你的这个胶制的也有问题。3，图上存在纵向拖尾，是不是你的电泳缓冲液用的次数太多了，全部换新的，结果会好的多！4，给现在你的试剂还都是国产的吗？这个实在够呛，买进口分装的也好，我有的就是分装的，效果也还不错！

• kulee (2013-8-17 15:52:29)

  
  聚焦程序变化不大，仅聚焦这一步改为10000V 60000hrs，酸性端加了Marker，但是梳子孔底边不平，所以跑出了的条带不平，电泳液一般用3次左右，是否重复次数太多了？下次一定都换新的。试剂大部分是进口分装的，个别是国产的，是否影响还很大？ 非常感谢！

• vivian4123 (2013-8-17 15:54:12)

  
  marker可以点在滤纸上，然后再放到二向胶上，我们是这么做的，你可以试试，效果挺好的。此外，要保证每次上槽里的2*电泳液每是新的，下槽的1*电泳液可以用个两三回没事，我比较过，新电泳液跑出的图效果要好。

• changlhsyo (2013-8-17 15:54:35)

  
  GE 24厘米 PH3-10NL的胶条，蛋白上样量是多少。用的是G250考染色

• kulee (2013-8-17 15:55:02)

  
  操作说明上好像是1~3mg吧