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【求助】晕！beta-actin都发不出来。。。。
刚刚开始做western blot，骨骼肌的蛋白。跑胶，转膜，敷抗体，一张膜发了5次，第一次片子曝光了，第二次只有很脏的背景，没有条带，然后第三次到第五次发光就是白板，没有任何的影。抗体最后达到1：1000，1:2000还是没有！以为是抗体和显影液定影液的事情，结果别的人跑的膜就能发出来！我的膜用丽春红染色也是有条带的！晕，beta-actin是肿么了。。。。。会不会是转膜的问题啊？各位帮帮忙啊。。。。。。唉，郁闷！【求助】晕！beta-actin都发不出来。。。。
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jkobn (2013-8-19 15:06:27)
既然丽春红染色膜上有条带就说明转膜没有问题。那在抗体上找找原因，你别是二抗孵错了，我有一次就是不小心，本来一抗是鼠抗，二抗孵成了抗兔的。
ii077345 (2013-8-19 15:08:35)
QUOTE:
恩，好的！我刚刚又核对了一下抗体，实验室用的二抗是羊的，刚刚分装的，一抗没有错！别人用这两个抗体发出来过，我打算用新的一抗再试试！总是白板，太郁闷啦！kuohao17 (2013-8-19 15:11:37)
确实丽春红染色结果可用来检测转膜效果，我们实验室用的预染marker，如果marker转到膜上的话 转膜应该就没问题，还有就是好像beta-actin 在骨骼肌表达很少吧，主要是alpha-actin 才对
ii077345 (2013-8-19 15:12:09)
QUOTE:
骨骼肌的beta-actin不少吧，我们实验室有一个人正在发啊，挺成功的呢！zhenxin (2013-8-19 15:12:34)
骨骼肌里b-actin含量很低，换个内参试试吧，GAPDH.
u234 (2013-8-19 15:13:48)
ii077345 (2013-8-19 15:14:45)
QUOTE:
~~是吗？说为什么了吗？我得查查呢！现在我都不太关心是不是骨骼肌的内参了，主要是我在联系，之前实验室有人发出来过，肯定是有的，我现在都是白板子。。。。不知哪出了问题！ii077345 (2013-8-19 15:15:14)
qqq111 (2013-8-19 15:15:51)
你的ECL有没有问题？
我同科室的一个研究员就因为ECL的原因，做了n久都没出来。
后来换了GE的ECL，以前expose失败的膜也出来了。
ii077345 (2013-8-19 15:16:37)
发了一个月的beta-actin,今天终于发出来了！激动死了~~~~
这整个就是一破案过程啊，一抗换了三种，都出不来，以为是电泳的问题，所有的试剂都换了新的，重新配了，也发不出来。最后才发现，是二抗失效。而且实验室的抗小鼠，抗羊的都失效了。。。。昨天来了新抗体，刚刚发的光，之前发不出来的膜，条带都很亮。。。。
心情很激动，老板很抓狂。。。。。
好吧，总结一下这艰难的一个月：
1、骨骼肌中beta-actin含量很多，我很确定，但是beta-actin能不能做内参，我还在查，请高人指点；
2、抗体很重要，真的很重要，其实我们之前想到过，但是没有想到这么多种二抗都失效了。。。。
3、引用一句话，再***的梦想也抵不过***的坚持。。。。
大家加油啊！
【求助】晕！beta-actin都发不出来。。。。