【求助】经过clean up kit处理后蛋白浓度很低

最新回复

• 66小飞侠 (2013-8-19 15:34:19)

  是否严格按照kit的说明书要求操作的？ 先看看你的样品中蛋白质量以及样品体积是否符合kit的要求。（用过bio rad的clean up，该kit对不同德样品，处理流程稍有差别）
  
  另外：
  
  用kit处理前 样品的质量大概有多少？
  
  经过kit处理后，是否有肉眼可见的沉淀，如果有，那应该还是有一定量的蛋白；
  
  还有，kit】处理后，重溶buffer的体积是否偏大，致使样品极度稀释，超出了RCDC的检测范围。
  
  -----
  
  其实也可以考虑其他的处理方法，如有机溶剂沉淀或分子筛等。当然这些方法各有特点，可以结合实验室情况以及样品情况具体选择！

• sunshine039 (2013-8-19 15:34:46)

  QUOTE:

  原帖由 66小飞侠 于 2013-8-19 15:34 发表
  是否严格按照kit的说明书要求操作的？ 先看看你的样品中蛋白质量以及样品体积是否符合kit的要求。（用过bio rad的clean up，该kit对不同德样品，处理流程稍有差别）
  
  另外：
  
  用kit处理前 样品的质量大概有多少？
  
  经过kit处理后，是 ...

  我的操作都是按照使用说明书来进行的，吸取100uL的样品，蛋白浓度控制在1~5mg/mL(Bio-Rad试剂盒的要求浓度），而且在经过Kit处理完后，也能看到肉眼可见的蛋白质沉淀，但使用Bio-Rad RC-DC蛋白定量试剂盒后测定的浓度就是很低，只有0.04mg/mL,根本无法达到水化上样的要求。
  
  我现在没办法，只能处理4管样品，kit处理完后，每管才加40uL的水化液，再合并成一管，这样才能勉强达到7cm胶条的上样要求，这样挺费试剂的。
  
  各位大侠，我想会不会是由于RC-DC蛋白定量试剂盒在处理我的样品时，将里面的蛋白质给处理掉了，而导致蛋白量较少，请各位多多指教！

• huifeng0516 (2013-8-19 15:35:10)

  G-BIOSCIENCES的质量比较好。我们实验室一直在用。

• sunshine039 (2013-8-19 15:35:38)

  QUOTE:

  原帖由 huifeng0516 于 2013-8-19 15:35 发表
  G-BIOSCIENCES的质量比较好。我们实验室一直在用。

  你指的是clean up kit试剂盒吗？多少钱啊

• huifeng0516 (2013-8-19 15:36:07)

  QUOTE:

  原帖由 sunshine039 于 2013-8-19 15:35 发表
  
  
  你指的是clean up kit试剂盒吗？多少钱啊

  是的，50次 2000元多一点

• zzzz (2013-8-19 15:36:32)

  我也遇到同样的问题，用clean up 前蛋白浓度1.4mg/ml ，用后，1.0mg/ml，可能是在操作是沉淀被tip头带走了，所以加试剂是tip头不要碰到液面。离心转速要超过13000rpm，否则蛋白未完全沉淀

• sunshine039 (2013-8-19 15:37:00)

  QUOTE:

  原帖由 zzzz 于 2013-8-19 15:36 发表
  我也遇到同样的问题，用clean up 前蛋白浓度1.4mg/ml ，用后，1.0mg/ml，可能是在操作是沉淀被tip头带走了，所以加试剂是tip头不要碰到液面。离心转速要超过13000rpm，否则蛋白未完全沉淀 ...

  我和你的情况还是有些不同，使用试剂盒处理样品时本身会有一部分损失的，这些很难避免的。
  
  但是我的蛋白损失也差的太离谱了，本来浓度还挺高的，但是一处理就差不多没了，你说这郁闷不？
  

• yueban-1147 (2013-8-19 15:37:54)

  我也是，本来提的大肠杆菌的蛋白浓度挺高的，有20mg/ml，后来一纯化，蛋白浓度最高只能达到1mg/ml,只能用来做银染，都不能用来考染，急死了

• orangecake (2013-8-19 15:39:44)

  是否严格按照kit的说明书要求操作的？ 先看看你的样品中蛋白质量以及样品体积是否符合kit的要求。（用过bio rad的clean up，该kit对不同德样品，处理流程稍有差别）
  
  另外：
  
  用kit处理前 样品的质量大概有多少？
  
  经过kit处理后，是否有肉眼可见的沉淀，如果有，那应该还是有一定量的蛋白；
  
  还有，kit】处理后，重溶buffer的体积是否偏大，致使样品极度稀释，超出了RCDC的检测范围。
  
  -----
  
  其实也可以考虑其他的处理方法，如有机溶剂沉淀或分子筛等。当然这些方法各有特点，可以结合实验室情况以及样品情况具体选择！
  
  ==========================================================================================================
  
  我觉的这个同学说的很好啊，我又试了下，纯化前的蛋白浓度是5mg/ml，100ul的体积，之后用的是200ul的水化液重溶蛋白，浓度是2.3mg/ml，虽然有点损失，不过还好了，以前用的重溶的水化液体积过大，导致蛋白浓度过低，我一直以为是这个试剂盒蛋白损失太大来着。。。误会这个试剂盒了。

• sunshine039 (2013-8-19 15:40:14)

  还有一个细节需要补充：我的蛋白浓度很低，我使用超滤管进行浓缩，会不会是超滤膜吸附了蛋白质，导致蛋白浓度降低呢

• zwsyrt (2013-8-19 15:42:24)

  QUOTE:

  原帖由 sunshine039 于 2013-8-19 15:40 发表
  还有一个细节需要补充：我的蛋白浓度很低，我使用超滤管进行浓缩，会不会是超滤膜吸附了蛋白质，导致蛋白浓度降低呢

  超滤进行浓缩，损失蛋白是不可避免的，回收率不可能100%。现有的浓缩方法几乎都存在这样的问题。
  
  你可以考虑通过类似的样品，做个预实验先评价下超滤管的回收率。 以确定你需要制备多少样品，才能保证后续的
  
  实验顺利完成
  
  另：既然是浓缩，蛋白浓度怎么回事降低呢？ 应该指的是蛋白质量吧