【求助】关于酶切位点

最新回复

• gogo (2013-8-20 13:12:46)

  
  使用PCR的方法，改造一些目的基因，把酶切位点改掉。
  或者找一个搭桥的酶切位点，三段连接。
  同尾酶神马的
  Infusion试剂盒，不通过酶切的直接连在载体上（我没用过）

• owanaka (2013-8-20 13:13:16)

  
  这个又没关系的，用重组的方法。片段PCR胶回收后，PCR产物与你的线性载体孵育，转化挑克隆就OK 了，一般长起来就是阳性克隆

• cbou876 (2013-8-20 13:13:50)

  
  可是PCR产物，如果不酶切怎么能和已经切好的载体连接？

• owanaka (2013-8-20 13:14:29)

  
  汗，不酶切就没法连接了? PCR产物回收后直接与酶切好的载体孵育，加上重组酶，室温一个小时就可以做转化了。
  
  很方便的

• gogo (2013-8-20 13:14:55)

  QUOTE:

  原帖由 owanaka 于 2013-8-20 13:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  汗，不酶切就没法连接了? PCR产物回收后直接与酶切好的载体孵育，加上重组酶，室温一个小时就可以做转化了。
  
  很方便的

  哦？我很感兴趣
  
  请问PCR引物怎么设计，重组酶从哪个公司能买到？

• cbou876 (2013-8-20 13:17:08)

  楼上的，我也很感兴趣，一个平末端，一个酶切后的粘性末端要用什么重组酶连接？还望指教

• birdfish (2013-8-20 13:18:33)

  载体处理之后-20C非常的稳定，分装保存一年之内都基本上不会失效
  
  使用DNA外切酶III确实存在切出单链片段长度无法控制，这也是LIC技术的主要问题存在。本实验中主要利用DNA外切酶III在4C条件下酶活性很低的特点进行处理，所以只能依据经验进行摸索，故DNA外切酶III的处理方法需要多加预实验才能成熟。（注：利用DNA外切酶III进行LIC应该是国内某实验室首创的，我们也只是学习而来）
  
  novagen的这个方法我也看过，确实是一个可控的方法，这个方法也可以自己手动进行，并不繁琐。

• gogo (2013-8-20 15:01:25)

  QUOTE:

  原帖由 birdfish 于 2013-8-20 13:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  载体处理之后-20C非常的稳定，分装保存一年之内都基本上不会失效
  
  使用DNA外切酶III确实存在切出单链片段长度无法控制，这也是LIC技术的主要问题存在。本实验中主要利用DNA外切酶III在4C条件下酶活性很低的特点进行处理， ...

  多谢，受教了。看了一些文献和说明书。打算两条路，同时试一试，希望能够顺利一些。比较喜欢外切酶的实验方法，简单一些，
  
  不过真不确定阳性率和稳定性……

• ladyhuahua (2013-8-20 15:01:57)

  
  确如所说，理论上看起来很不错的方法在实际中不一定能做出来，我建议你还是多看看，我曾经用这个方法做克隆成功了。但后来还是放弃使用了，主要稳定性确实不尽人意。

• gogo (2013-8-20 15:02:55)

  QUOTE:

  原帖由 ladyhuahua 于 2013-8-20 15:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  确如所说，理论上看起来很不错的方法在实际中不一定能做出来，我建议你还是多看看，我曾经用这个方法做克隆成功了。但后来还是放弃使用了，主要稳定性确实不尽人意。 ...

  嗯，看来，Takara的Infusion还真是比较不错，不知道他那个Infusion酶到底是什么东西，特殊的重组酶？还是能把那个搞出来比较好。另外Novagen的方法，多摸索摸索也大有希望，比较商品化这么多年了，稳定性理应有所保障