【求助】GST标签蛋白不挂柱 洗脱前后洗脱buffer 的pH 变化很大

最新回复

• sunnyB (2013-8-20 15:32:20)

  GST丢失活性，当然无法结合

• 49888 (2013-8-20 15:32:38)

  
  我正准备上GST柱子纯化蛋白，不知道你的问题解决了没有。有问题多交流。
  
  有几点你需要注意：
  
  1、蛋白都是包涵体，这种情况最好先优化一下诱导条件，把诱导温度降下来，甚至可以16度诱导过夜，看看能不能提高蛋白的可溶性。
  
  2、蛋白挂不住，出了填料失活之外，主要的是要注意上样的流速不要太快，尽可能慢点，快了结合不上。

• XYZQ (2013-8-20 15:32:57)

  1. 过GST柱最好先和蛋白溶液孵育1-2小时，然后过柱子效果比直接流过好。
  
  2. 洗脱液加还原性谷胱甘肽后pH下降很大，所以一定要把pH调回来。

• dreaming (2013-8-20 15:33:20)

  
  谢谢大家！多多交流~
  
  我再摸一下诱导的条件，看看能不能诱导成可溶的蛋白~
  
  我是把GST柱先和蛋白溶液孵育了1.5小时，然后过的柱子；
  
  “洗脱液加还原性谷胱甘肽后pH下降很大，所以一定要把pH调回来。”是指洗脱后将洗脱液的pH调过来么？我的洗脱液的pH本来是8.0。调回来有意义么
  
  ？ 还有就是它的pH为什么会变化这么大呢？

• 04906 (2013-8-20 15:33:39)

  复性后要么GST失活了要么就是该标签被包埋了，可以考虑下换个标签，比如His什么的，可以在变性的条件下直接上柱，这种蛋白－beads之间的结合不依赖于酶活性以及融合蛋白的构象。

• mimili_901 (2013-8-20 15:34:17)

  
  跟上样流速关系不是很大,你上样前脱盐了没,PH找的对么,蛋白是否还有活性

• dreaming (2013-8-20 15:35:51)

  我透析了，至于盐有没有脱完，我不知道；pH值也是对的，没有问题；透析后我的蛋白是有活性的

• sr9971 (2013-8-20 15:37:09)

  肯定是GST复性不好。可以溶解不一定有活性。
  
  一般表达量很高的蛋白还会有部分是可溶表达的，可以大量表达后取上清纯化试试

• youyou99 (2013-8-20 15:37:30)

  我前些天刚做完一个GST标签的蛋白，对于你提出的问题，我的建议是：
  
  1. 你的菌要做低温诱导表达，让其尽可能的可溶性表达。
  
  2. 超声时，可以用20/50mM的Tris-HCl缓冲液，pH值8.0—9.0之间，这样使你的蛋白尽可能在上清中，然后调样品的pH值为7.5左右，再上GST柱子。
  
  3. 解离时，50mM的Tris-HCl缓冲液+10/15mM的GSH，一定调溶液的pH值为8.0左右方可解离样品（因为缓冲液中加入GSH后，其pH值会下降很大）。