【讨论帖】pET32a+在BL21DE3中的表达

最新回复

• NBA (2013-8-27 15:50:13)

  
  溶氧也是必须的

• moonlight45 (2013-8-27 15:51:32)

  给氧量是否充足会影响蛋白的产量及蛋白的可溶性。
  如果目的蛋白主要分布于包涵体，而需要目的蛋白以可溶形式表达的时候，可以考虑适当减少每个摇瓶内培养基的量以改善供氧情况。

• 大海啊故乡 (2013-8-27 15:51:53)

  o 茅塞顿开......正如楼上所说,我收集的是可溶的目的蛋白,同时有相当的目的蛋白是包涵体
  我今天在比较不同培养基百分比对可溶性目的蛋白表达量的影响.

• 大海啊故乡 (2013-8-27 15:53:09)

  
  别具了。。。。还是不行。。试过用少一点medium但是表达量还是很低。。。
  
  之前师姐做的时候表达量很高，但是不知道为什么我用相同的条件就表达不出来。。。。

• 大海啊故乡 (2013-8-27 15:53:33)

  
  大家用LB medium的时候都调不调pH呀？pH调到7.5？

• tuuu2 (2013-8-27 15:54:22)

  
  我一直都是用2L瓶子要1L这个氧气没问题，你要优化的是诱导的温度，和诱导时间啥的

• 大海啊故乡 (2013-8-27 15:54:53)

  
  多谢楼上, 我正在优化时间和IPTG, 温度还没有优化.

• 大海啊故乡 (2013-8-27 15:56:49)

  
  昨天问了过去提这个蛋白的师姐,她指出了一个过去我没有想过的问题.
  
  我一直都是用BL21来扩增质粒,而当时师姐用的DH5a.可能是质粒的质量不高?
  
  我后来测了我提的质粒的浓度, 50ng/ul 是不是有些低呀.

• 大海啊故乡 (2013-8-27 15:59:09)

  
  自己顶一下, 大家transform competent cell用的质粒是从DH5a 还是BL21上提的.
  有没有可能, BL21提出来质粒质量比较差, 所以当我再次transform BL21来提蛋白的时候产量降低???

• jrwyyplt (2013-8-27 15:59:27)

  
  建议你把提出的质粒重新转化一次BL21，也许会有效果

• jrwyyplt (2013-8-27 16:02:40)

  就我了解，质粒不存在质量差别吧，而且这个浓度都是足够转化的，你表达的温度再考虑一下

• 大海啊故乡 (2013-8-27 16:03:09)

  就我了解，质粒不存在质量差别吧，而且这个浓度都是足够转化的，你表达的温度再考虑一下
  
  ==================================
  
  thx! en 我正在试,似乎应该没有差别..........

• 987789 (2013-8-27 16:03:31)

  
  你这个细菌是最近才转化的还是之前甘油保存的
  如果是你之前保存的细菌的话建议你用质粒重新转化BL21一下。
  
  另外你的基因是真核的基因还是原核的
  之前你师姐用的什么表达菌株？
  
  如果是真核基因的话，很有必要考虑一下密码子的使用频率，
  如果有大肠杆菌的稀有密码子的话兄弟就得考虑一下表达菌株，比如Rosetta。。。
  
  祝兄弟好运。。

• 大海啊故乡 (2013-8-27 16:04:18)

  QUOTE:

  原帖由 987789 于 2013-8-27 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你这个细菌是最近才转化的还是之前甘油保存的
  如果是你之前保存的细菌的话建议你用质粒重新转化BL21一下。
  
  另外你的基因是真核的基因还是原核的
  之前你师姐用的什么表达菌株？
  
  如果是真核基因的话，很有必要考虑一下 ...

  thx!! 这个菌是刚刚转化不久的(新的甘油冻存),我已经把摸索条件的结果发上去了, 我还会继续摸索.最近会做测续,看看是不是产生了稀有密码子.....

• pencil菲 (2013-8-27 16:04:38)

  thx!! 这个菌是刚刚转化不久的(新的甘油冻存),我已经把摸索条件的结果发上去了, 我还会继续摸索.最近会做测续,看看是不是产生了稀有密码子.....

• utt0989 (2013-8-27 16:05:16)

  
  晓得是不是你的处理样品时的问题~我最近也在做~表达量也不大~恼火得很啊~

• tuomu45 (2013-8-27 16:05:53)

  很多人用BL21(DE3)表达外源基因的时候发现，随着菌种传代次数的增加，表达效果可能会变差。有时候即使是一些外源蛋白表达得非常好的重组菌也会出现这种情况。这其实与质粒在BL21中的稳定性有很大的关系。曾做过BL21(DE3)质粒稳定性的实验，在没有诱导剂存在的情况下，Amp维持的pET32a-外源表达质粒的丢失率可在液体培养8小时后达到30%。这与外源基因应该有一定关系，因为pET32a空载体在BL21(DE3)中的稳定性要好一些。另外Kan维持的pET28a质粒丢失率则明显少一些。因次我常用的方法是将液体菌种稀释涂平皿挑单菌落液体培养至对数生长期再保存，一般不需要提质粒重新转化。
  
  用pET系列载体表达外源基因的时候IPTG浓度对表达量的影响是很难控制的，IPTG几乎就是一个开关效应，0.1mM和1mM的IPTG诱导效果常常是一样的。如果蛋白以包涵体的形式存在，首先就要分析你的蛋白质是否适合在细胞质内折叠形成可溶形式。如果要进行优化的话，建议首先优化诱导温度如将37度降到28度甚至18度。控制菌种质量并将诱导前的OD值严格限制在较低水平。
  另外你可以尝试自诱导培养基，在乳糖和葡萄糖同时存在的情况下，可以较好的平衡生长和诱导的矛盾，过夜培养后往往能得到很好的表达效果。

• zhezhe (2013-8-27 16:06:32)

  
  除了IPTG的浓度，诱导温度对蛋白表达的影响也很大。你试试18度，25度等。
  至于诱导时间，你可以在不同的时间点取样跑电泳观察。
  再不行，做个测序确认一下序列是否正确。

• 大海啊故乡 (2013-8-27 16:07:18)

  QUOTE:

  原帖由 tuomu45 于 2013-8-27 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  很多人用BL21(DE3)表达外源基因的时候发现，随着菌种传代次数的增加，表达效果可能会变差。有时候即使是一些外源蛋白表达得非常好的重组菌也会出现这种情况。这其实与质粒在BL21中的稳定性有很大的关系。曾做过BL21(DE3) ...

  thx!!.
  我师姐曾经做过这个蛋白，当时的表达量高的惊人，在27kd的位置上面是一大团蛋白.
  我现在无论如何优化, 永远都达不到她当时的效果. 问题是我们用的是相同的质粒,相同的菌, 我是新鲜做的转化.....一样的步骤..为什么结果差的这么远呢??

• 8princess8 (2013-8-27 16:09:17)

  你跟你师姐的蛋白电泳上样量是否一样呢？