【求助】为什么我的镍柱加了溶液后会变黄色

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-8-27 16:21 作者: sunshine039 来源: 分析测试百科网

各位师兄师姐：
我的包涵体是在8M脲素，0.1M DTT，20mMTris-cl， PH10.0里溶解的
然后我把新买的GE镍柱填料取出200ul 离心后去上清，用蒸馏水洗了2遍柱子，然后把柱子用8M脲素，0.1M DTT，20mMTris-cl， PH10.0溶液平衡然后我把我的包涵体溶解的样品加入柱子后，发现镍柱变成黄色了请问这是为什么呢
谢谢各位师兄师姐

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junhun (2013-8-27 16:22:40)

DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑beta-巯基乙醇或TECP。
sr9971 (2013-8-27 16:23:02)

Ni柱不能有DTT，一点点都不能有。可以用Ni-NTA可以耐受10mM左右的2-ME，如果是Ni-IDA就连2-ME都不能有。你那些被还原的填料可以在空气中缓慢氧化变回正常，然后用EDTA洗掉Ni，再用NiSO4重新上Ni就可以用了
xyw5 (2013-8-27 16:23:44)

你使用的DTT浓度太高了，0.1M，你看一下GE的说明书，如果我没有记错的话，他们的ni柱只能耐受1mM的DTT，还原剂过高，造成Ni被还原。可以将ni柱重生，重新挂镍离子。
nut6694 (2013-8-27 16:24:42)

你好，我想问一下你的包涵体缓冲液为什么会选用pH10.0？可以解释一下吗？还有，你的目的蛋白定义为包涵体，我想问一下你超声后除了目的蛋白在沉淀里以外，还有别的很多蛋白在沉淀里面吗？大肠杆菌里面表达的蛋白大部分都应该是可溶的，所以绝大部分蛋白都应该在上清中，只有极少数的蛋白在沉淀，但是我做很多次很多蛋白质都在沉淀中，上清中很少，我觉得不是超声的问题，我2ml的菌30%功率，超4s停2s，总8min。交流一下，我之前做过一个pET28a的，做出来挺好的。现在在做32a的。
qqq111 (2013-8-27 16:25:11)

"大肠杆菌里面表达的蛋白大部分都应该是可溶的，所以绝大部分蛋白都应该在上清中，只有极少数的蛋白在沉淀"，楼上的，
这样的结论太草率，我们筛过上千种蛋白的表达测试，表达在沉淀的占了近一半。
具体问题具体分析吧，实验上没有一定是什么的，即使是相同的菌株，相同的实验方法，相同的操作者，不同的的操作环境，也可能产生完全不同的结果。
因此文献或者别人的结果也只能做参考，不能作为绝对的依据，如果自己各部分的操作都没有问题，就应该大胆地相信自己，并且根据自己得到的结果来设计实验。
DDD (2013-8-27 16:25:30)

DTT的还原性太强，可以说与Ni柱不兼容，那些标称自己能耐受较高还原剂的填料其实也不是很好，50mM β-ME都不行
nut6694 (2013-8-27 16:26:01)

大肠杆菌里面表达的蛋白大部分都应该是可溶的，所以绝大部分蛋白都应该在上清中，只有极少数的蛋白在沉淀"，楼上的，
这样的结论太草率，我们筛过上千种蛋白的表达测试，表达在沉淀的占了近一半。
具体问题具体分析吧，实验上没有一定是什么的，即使是相同的菌株，相同的实验方法，相同的操作者，不同的的操作环境，也可能产生完全不同的结果。
因此文献或者别人的结果也只能做参考，不能作为绝对的依据，如果自己各部分的操作都没有问题，就应该大胆地相信自己，并且根据自己得到的结果来设计实验。

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不好意思，我的意思是说大肠杆菌自身表达的蛋白基本上都是可溶的，如果你的重组蛋白表达的是包涵体的话，超声后，在沉淀中的蛋白应该主要是你的目的蛋白吧。
cocacola (2013-8-27 16:27:02)

DTT与Ni离子结合了，用低浓度的 β-ME 代替吧
我用了10 mM 浓度，效果可以
memory (2013-8-27 16:27:26)

我们也出现了相同的问题，DTT浓度太高了，参考GE说明书，降低DTT浓度就可以了。