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【求助】western 白板啊，请各位高手指教
最近刚开始做western，曝光后什么都没有，甚至连膜的痕迹都看不到，用的是nc膜，转膜用的是bio-rad的半干转，20v 40min，封闭用的是5%BSA,封闭40min，一抗是actin用2.5%BSA+TTBS稀释的，二抗是国产羊抗兔，ecl用的是中衫的。一抗和膜都是借别的实验室的，证实过好用的，开始怀疑是ecl有问题，后来在膜上点上二抗再点ecl确实会发光。转膜时预染marker转的非常好，借我抗体的那个人说膜加上ecl后就会出现非常亮的actin条带，可是我的膜是漆黑一片，现在就是找不到不出条带的原因，非常困惑，希望大家帮帮忙，非常感谢！【求助】western 白板啊，请各位高手指教
非常感谢网友们的帮助，最近又跑了几次，改善了转膜条件，bio-rad 半干转，恒压20v 1h 15min，然后杂一抗和二抗，曝片后能看到条带，但是非常弱。我怀疑是底片和ECL的问题。以前都是压3min-5min，现在每次都是压片1h以上。不知道大家都用的什么底片？我师弟买的是乐凯的MXG感蓝，发光试剂盒是中衫分装Santa的，我现在怀疑我前面的过程可能没有问题，是不是在曝光压片这里出了问题。大概查了一下，好像没人用MXG啊，是不是因为这个底片是慢曝光的啊？ 谢谢各位战友
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最新回复
cocacola (2013-8-27 16:30:01)
X光片子曝光了
avi317 (2013-8-27 16:31:57)
首先,转膜结束后用丽春红染色检查转膜的效果了吗? Marker有时候真的不能说明问题的,丽春红染色检查你的蛋白条带是最为直接的方式.
排除转膜的缘故的话,可能抗体的条件不是很合适,可以的话最好也问你要抗体的实验室再要些二抗,(如果能要到他们做过actin的样品那是最好了),严格按照他们的操作条件做一次,
另外,不知你的样品是组织样品还是细胞样品?组织样品的话,建议自己加个细胞的样品作为control,细胞样品的上样量取30~40 ug。
nvdabing (2013-8-27 16:32:24)
排除转膜的缘故的话,可能抗体的条件不是很合适,可以的话最好也问你要抗体的实验室再要些二抗,(如果能要到他们做过actin的样品那是最好了),严格按照他们的操作条件做一次,
另外,不知你的样品是组织样品还是细胞样品?组织样品的话,建议自己加个细胞的样品作为control,细胞样品的上样量取30~40 ug。
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开始用的是生工的pvdf膜，立春红染了，粉嫩嫩一片，脱都脱不掉而且看不到条带，后来问人要了块好用的nc膜，就没再染过了。SDS没有问题，平行两块胶我也考染过转膜后的胶，胶上残留蛋白并不多。我的样品是组织样，小鼠肝脏，上样150ug，样品是给我试剂的那个人按照她的方法提的，他以前做都没有问题，我就是做不出来，太郁闷了！
avi317 (2013-8-27 16:32:43)
强烈建议转膜后丽春红染色检查下有多少蛋白转移过去了，除非你已经非常熟练，确定绝大多数情况下这一步以及之前的所有操作都没有任何问题。
还有你考马斯亮蓝染转膜后的胶看到残留的蛋白不多，也不能直接说明大部分蛋白转移到你的膜上了，也有可能转过了到了滤纸上呢（nc膜还是比较容易转过了的）
样品最好直接问她要，不排除你操作中某些细节没有注意到导致样品准备失败的可能性，即使你对自己的样品比较有把握，也可以把她的样品作为阳性对照，你觉得呢？
ffooll (2013-8-27 16:33:02)
1、一般预染marker能转到膜上比较清晰的话，那么转膜这个过程一般是没有问题的，因为marker也是蛋白嘛。至于用丽春红染膜的话，有空染染无所谓，只不过染出来有无蛋白残留都不能说明什么问题，因为染膜这个方法跟ECL的敏感度比不是一个数量级的。
2、希望楼主从配液体开始想想自己的操作步骤与别人实验室有哪些地方是不同的，到时再拿出来给大家分析一下。我们实验室当年试过，AP没有现配，一段时间都是做白板。
谢谢！
avi317 (2013-8-27 16:33:25)
就如你所说，ECL的灵敏度比丽春红染色要高很多很多。丽春红染色看到的只是细胞内的一些骨架蛋白或者其他丰度很高的蛋白，如果这些蛋白的转膜的效果都比较差，染色后看不到蛋白条带的话，我很难想象你的丰度较低的目的蛋白转膜效果会很好；此外，丽春红染色的另一个好处在于通过观察高分子量蛋白端的蛋白条带的状况，可以反映你的样品是否有发生蛋白降解。
个人观点，欢迎讨论。
ffooll (2013-8-27 16:34:38)
就如你所说，ECL的灵敏度比丽春红染色要高很多很多。丽春红染色看到的只是细胞内的一些骨架蛋白或者其他丰度很高的蛋白，如果这些蛋白的转膜的效果都比较差，染色后看不到蛋白条带的话，我很难想象你的丰度较低的目的蛋白转膜效果会很好；此外，丽春红染色的另一个好处在于通过观察高分子量蛋白端的蛋白条带的状况，可以反映你的样品是否有发生蛋白降解。
个人观点，欢迎讨论。
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您说的这些我都认同。但不知楼上有无试过丽春红染不出蛋白，但曝光仍有条带。虽然为什么会这样我不会解释，但我们实验室有试过，所以现在一直以来我们都不用丽春红。判断转膜效果我们一般看预染marker的深浅，因为我们每次WB上的marker量大致一样，那么通过和以往marker的深浅比较可以大概估计转膜的效果。毕竟marker也是蛋白，而且有不同的分子量。当然，这得确保样品的蛋白没有被降解。
欢迎批评指正。
nvdabing (2013-8-27 16:36:26)
QUOTE:
我看大家蛋白一般都上几十微克，我每次上150ug，就算是转膜效率不高也应该足够用了吧？而且每次预染marker都转的很好，对于40kD的蛋白 20v恒压转1h应该转不过去nc膜吧？qhyu (2013-8-27 16:41:36)
你是半干转吗？
我们实验室之前半干转一般20V，30min或者湿转100V，60min，30~60kDa的蛋白都没太大问题，用的是PVDF膜
nvdabing (2013-8-27 16:42:52)
QUOTE:
是半干转，用的是bio-rad的，20v 1h，膜是nc膜。我感觉彩虹marker好像很容易过去，稍微转一下就过去了，所以拿这个判定不了转膜效率。【求助】western 白板啊，请各位高手指教