【求助】TCA-丙酮沉淀时使用90%的丙酮来代替丙酮溶液...

最新回复

• duoduo (2013-8-30 10:59:15)

  
  你的TCA丙酮沉淀是怎么操作的？溶液如何配制的？一般用TCA沉淀即可除去一般的非蛋白杂质，然后丙酮洗涤的目的是改变其pH值，方便后续液体溶解。这样操作，一般蛋白都能溶解下来，不要用丙酮去沉淀蛋白，不然会导致你说的那种难溶解情况。
  90%的丙酮这个方法没试过，如果我上面说的方法不适合你的情况，你可以自己试一试就知道了。

• 子衿青青 (2013-8-30 10:59:55)

  QUOTE:

  原帖由 duoduo 于 2013-8-30 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你的TCA丙酮沉淀是怎么操作的？溶液如何配制的？一般用TCA沉淀即可除去一般的非蛋白杂质，然后丙酮洗涤的目的是改变其pH值，方便后续液体溶解。这样操作，一般蛋白都能溶解下来，不要用丙酮去沉淀蛋白，不然会导致你说的那种难溶 ...

  谢谢你的回答
  我先用TCA-丙酮溶液（含10%TCA、20mM DTT的丙酮溶液）来沉淀蛋白样品1h,后离心沉淀；
  再用90%的丙酮溶液（含10%的双蒸水）来清洗沉淀蛋白，去除残留的TCA和盐离子。
  我之前第二步都是用100%的丙酮处理，造成蛋白质很难重新再溶解，现在我想改用90%的丙酮试试，不知道效果如何

• lxh031 (2013-8-30 11:00:14)

  
  楼上，我们一直是100%冷丙酮沉淀，然后用90%丙酮洗涤沉淀。楼主可以试试

• 子衿青青 (2013-8-30 11:00:55)

  QUOTE:

  原帖由 lxh031 于 2013-8-30 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  楼上，我们一直是100%冷丙酮沉淀，然后用90%丙酮洗涤沉淀。楼主可以试试

  好的，谢谢，我现在也是这样操作的，但是还是有些难溶情况发生。
  你们后面用丙酮清洗的话一般会清洗几遍呢？我洗三遍，发现蛋白要损失一大半
  

• hustwb (2013-8-30 11:03:27)

  
  一般丙酮沉淀下来的蛋白是比较难溶的，我建议楼主在丙酮沉淀后不要晾的太干，加入裂解后，用枪头将沉淀吹散，然后可以使用超声波清洗器超声助溶，效果不错的。

• xyw5 (2013-8-30 11:04:00)

  请问你们洗涤的时间总共是多长？洗涤是不是就是将沉淀和丙酮混匀后，离心这样操作的？还有楼上说的洗涤结束后加裂解液，用超声助溶的方法，超多久，超声过程不会产热吗？这样蛋白会不会降解啊

• xingyi08 (2013-8-30 11:04:31)

  透析处理后超滤应该是个解决方法。

• dongdongqiang (2013-8-30 11:05:15)

  
  一般超声5分钟左右能溶，可以往洗涤器中加冰盒中融化的冰水，在处理过程中不断补充，保持低温。

• 子衿青青 (2013-8-30 11:05:58)

  
  你们用丙酮来清洗沉淀时，一般会清洗几次啊？我现在用丙酮清洗沉淀的蛋白洗了三次，发现蛋白会损失一大半？你们一般离心是按照离心力还是转速来离心的啊？我用的是12000rpm离心沉淀，但是有时候感觉有些蛋白离心不下来