【求助】细胞刮刮下细胞后可不可冻存？

最新回复

• rxcc33 (2013-8-30 13:15:54)

  
  如果冻存来以后用来做IB/提RNA等的话可以。但是如果冻存后以后还复苏当然不行，其一是用细胞刮有一定的机械损伤，其二是没有保护剂（DMSO）等，细胞冻融过程中就全裂解掉了。

• pencil菲 (2013-8-30 13:16:24)

  我想用这些冻存的细胞提蛋白，因为我需要的细胞的量比较多，所以多收集几次，然后一起来提蛋白，这样的话用胰酶或者用细胞刮将细胞收集起来应该没什么问题吧，用胰酶后者用细胞刮来收集细胞，那个方法对细胞的损害比较小呢，同时还不影响蛋白质的提取。谢谢楼上这位大哥

• rxcc33 (2013-8-30 13:17:29)

  
  真要说对细胞的损害，那应该是胰酶比较小。不过单纯用细胞刮还是安全的，细胞刮本身的机械作用很难让细胞膜破裂，前提是你在冰上小心操作。而且你最好每次都分管收集，不要几次的都收集到一个管中。

• yonger (2013-8-30 13:17:52)

  你提取蛋白，胰酶最好不要加，蛋白酶会水解你的蛋白或者带来杂蛋白。

• pencil菲 (2013-8-30 13:18:18)

  你提取蛋白，胰酶最好不要加，蛋白酶会水解你的蛋白或者带来杂蛋白。
  
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  那就直接用细胞刮刮取就可以了哈。用细胞刮取离心后收集细胞，可不可以将细胞直接放在-80°C里，等用的时候再拿出来提取蛋白，谢谢哈

• cwcwcww (2013-8-30 13:19:07)

  
  可以-80度冻存。
  将要收集平皿中的细胞用PBS洗两遍，然后再加入1mlPBS，用细胞刮子刮下来，用移液器转到EP管中，3000转，离心5min,弃掉PBS，将细胞沉淀放在-80度冰箱备用。

• cwcwcww (2013-8-30 13:19:34)

  
  提蛋白时直接从-80度拿出来加入裂解液就行。注意冰上操作以防蛋白质降解

• 68943512yao (2013-8-30 13:20:07)

  即使放-80°也会有降解，只不过降解速率问题了，对实验其实不好。可以换种思路解决这个问题，可以先配好裂解液，里面加蛋白酶抑制剂。等把细胞刮下回收后，在管子里加少量裂解液然后冻存，等最后把所有的混合起来就可以了。

• pencil菲 (2013-8-30 13:20:51)

  QUOTE:

  原帖由 68943512yao 于 2013-8-30 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  即使放-80°也会有降解，只不过降解速率问题了，对实验其实不好。可以换种思路解决这个问题，可以先配好裂解液，里面加蛋白酶抑制剂。等把细胞刮下回收后，在管子里加少量裂解液然后冻存，等最后把所有的混合起来就可以了。 ...

  这样也可以呀，不过这种方法我很少见，可以试一下，你用这种方法做过没有？提取的蛋白量怎么样？

• pencil菲 (2013-8-30 13:21:10)

  QUOTE:

  原帖由 cwcwcww 于 2013-8-30 13:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  可以-80度冻存。
  将要收集平皿中的细胞用PBS洗两遍，然后再加入1mlPBS，用细胞刮子刮下来，用移液器转到EP管中，3000转，离心5min,弃掉PBS，将细胞沉淀放在-80度冰箱备用。 ...

  这些也全都是在冰上操作吗？PBS是不是用4度的，离心的时候也要在四度吧。EP管里的PBS肯定不会弃的那么彻底，可不可以用滤纸吸干？这样做应该对提取的蛋白没什么影响吧?谢谢各位帮忙。
  

• sunnyB (2013-8-30 13:21:40)

  这样也可以呀，不过这种方法我很少见，可以试一下，你用这种方法做过没有？提取的蛋白量怎么样？
  
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  用过，否则我不会建议你用的，提取的蛋白量没什么问题，和你的细胞数有关，你只要收到5X105-106细胞数，总的裂解液用50-100微升，蛋白浓度可以达到5-10ug/ul.