【求助】离子交换柱（SPHP)使用两三次后，蛋白不挂柱子了？

最新回复

• caihong (2013-8-30 17:53:24)

  
  纯化规模，用了多大的柱，再生程序，纯化仪器？
  
  为什么SP用了HP和FF两种？
  
  你的“两三次后”具体含义？
  
  是指相同的蛋白样品分成几份分别上样？
  这样你的问题出现可能与再生程序有关。
  
  还是一个蛋白样品全部过一次柱，然后把穿透样品再做下一次？
  这样可能在全部的蛋白样品溶液中，只有部分目标蛋白具有纯化所有的电荷特征。具体原因不明，参看帖子后面的链接。
  
  还是不同批次的蛋白样品溶液上样？
  这个问题就复杂了，无法分析。
  
  离子交换柱用碱再生后要用大量的平衡缓冲液去平衡，不知道你是如何判断平衡完成的？
  
  柱子里的基团是共价键连接，在通常的使用条件下不会受损。
  
  柱子的标注载量是在一定条件下对特定蛋白测定的，与你的操作蛋白不符合很正常。
  
  一般我这里离子交换柱的载量实际应用时大约在10-20mg/ml左右。
  
  你的问题还可以参看一下这个帖子：
  cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/13329147?tpg=1&ppg=1&age=0#0')
  如果是这个帖子中的情况，目前我也没有找到答案。
  曾经有个战友说他解决了这个问题，但没有说明方法。

• 土坷垃 (2013-8-30 17:54:05)

  柱子：XK26/20（填料 60ml，新填料,SPHP）用的是AKTA纯化设备
  Load: 1 g包涵体溶解上清，约300 mg蛋白（蛋白绝对没有超载），蛋白溶解在bufferA中。
  Buffer A: 8 M Urea，20 mM NaA c，20 mM ME，0.15 M GuaHCl, PH=5.0
  Buffer B: 8 M Urea 1M NaCl，20 mM NaAc，20 mM ME，PH=5.0
  Buffer C: 1M NaCl，20 mM NaAc，20 mM ME，PH=5.0
  用BufferC，B，A平衡3CV后，上样。
  柱子每次都再生的，NaOH清柱子后，水平衡，电导降到0.1ms/cm 左右后，用C，B，A平衡。
  1.都是的样品，都是新鲜的配置，并且buffer也都是新配置。
  

• 土坷垃 (2013-8-30 17:56:07)

  每次都是用新鲜的load，FT即使穿透了，也不要了。
  
  1. 为什么第一次目的蛋白全部挂柱，第二次蛋白仅仅是末尾那点不挂柱，第三次一上来就不挂柱子了？
  2. 后重复过一次，新填料，也是前两次挂柱效果还可以，第三次后效果就不行了？
  3. 填料载量不高，远小于说明书中的载量。

• 土坷垃 (2013-8-30 17:56:26)

  
  每次都是用新鲜的load，FT即使穿透了，也不要了。
  
  1. 为什么第一次目的蛋白全部挂柱，第二次蛋白仅仅是末尾那点不挂柱，第三次一上来就不挂柱子了？
  2. 后重复过一次，新填料，也是前两次挂柱效果还可以，第三次后效果就不行了？
  3. 填料载量不高，远小于说明书中的载量。

• 土坷垃 (2013-8-30 17:56:53)

  
  这个是三次过柱的层析图

  
  20128394.png

• 6327555 (2013-8-30 17:57:26)

  
  可能蛋白没有完全洗脱，第三次过载了

• 土坷垃 (2013-8-30 17:59:00)

  蛋白已经被NaOH清柱，全部清理下来了，不会有蛋白过载的现象的。

• INK (2013-8-30 17:59:24)

  
  试试1MNaCl+0.5M NaOH处理下层析柱

• jujuba (2013-8-30 18:00:55)

  你有没有算一下蛋白的回收率？