【求助】原核表达纯化

最新回复

• viviwang1987 (2013-8-31 11:00:39)

  
  1、纯化过程加蛋白酶抑制剂PMSF，看能否防止降解
  2、透析前的蛋白质做一个蛋白质降解实验，每隔一段时间取样电泳，看是不是有降解。如果没有降解的话，那可能是你后续处理的问题了。建议采用超滤的方法脱咪唑和浓缩，效果相当的好。
  3、如果还是效果不好，那就换载体试一试

• applebook=213 (2013-8-31 11:01:15)

  变杂了？分子量是变大了还是变小了？如果是变小了，应该是降解，如果是大了，考虑是不是你的蛋白跟PEG有结合

• mamamiya (2013-8-31 11:01:36)

  首先镍柱纯化一步得到的蛋白质纯度不会特别的高，另外透析去除咪唑的过程有多久？温度？还有你蛋白质本身的稳定性？再者你蛋白上面除了his标签是否还有别的，如果有的话可能是断裂了。
  建议你如果透析过程中没有沉淀的话可以采用超滤法，去咪唑的同时浓缩。

• fox_79 (2013-8-31 11:03:18)

  QUOTE:

  原帖由 mamamiya 于 2013-8-31 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  首先镍柱纯化一步得到的蛋白质纯度不会特别的高，另外透析去除咪唑的过程有多久？温度？还有你蛋白质本身的稳定性？再者你蛋白上面除了his标签是否还有别的，如果有的话可能是断裂了。
  建议你如果透析过程中没有沉淀的话可以采 ...

  一般是透析一天 4度

• 66+77 (2013-8-31 11:03:39)

  
  浓缩后的蛋白变浓了，同时杂蛋白也变浓了，电泳下能看到你的蛋白变杂了也是正常的，先确定是否如你所想的是降解，如果不是，可能就是只用镍柱一步纯化的效果不理想，可以尝试再过一个离子柱

• fox_79 (2013-8-31 11:04:08)

  QUOTE:

  原帖由 66+77 于 2013-8-31 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  浓缩后的蛋白变浓了，同时杂蛋白也变浓了，电泳下能看到你的蛋白变杂了也是正常的，先确定是否如你所想的是降解，如果不是，可能就是只用镍柱一步纯化的效果不理想，可以尝试再过一个离子柱 ...

  但是浓缩后我是稀释到同等浓度比较的，降解的话 再过柱它还是会降解
  谢谢你

• gogo (2013-8-31 11:05:04)

  先做蛋白稳定性实验，如果很不稳定，建议用超滤减少浓缩时间

• fox_79 (2013-8-31 11:05:36)

  QUOTE:

  原帖由 gogo 于 2013-8-31 11:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  先做蛋白稳定性实验，如果很不稳定，建议用超滤减少浓缩时间

  嗨 真是没办法啊 都不知道怎么办了
  

• skytree (2013-8-31 11:06:40)

  
  样品中加一些EDTA再透析、浓缩试试看。

• fox_79 (2013-8-31 11:07:14)

  QUOTE:

  原帖由 skytree 于 2013-8-31 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  样品中加一些EDTA再透析、浓缩试试看。

  嗯 谢谢你 我在尝试 请问应该加多少啊？

• skytree (2013-8-31 11:07:46)

  QUOTE:

  原帖由 fox_79 于 2013-8-31 11:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  嗯 谢谢你 我在尝试 请问应该加多少啊？

  1-5mM。

• u234 (2013-8-31 11:08:31)

  镍柱纯化能90%纯度左右已经相当不错了，蛋白浓缩后感觉杂带变多大部分是前后上样量不一样造成的。比如浓缩前上5ug，浓缩后相同体积就能上20ug，这时候杂带就很明显
  如果要求纯度95%的话还是再加根别的柱子吧

• gogo (2013-8-31 11:09:04)

  我在做原核表达时，加了组氨酸标签，然后用镍柱纯化，纯化出来的蛋白跑电泳条带很好，纯度很高，但是用PBS透析掉咪唑，再用聚乙二醇浓缩后，然后再去跑电泳，条带变杂了很多，我怀疑是蛋白降解了，请问各位高手 怎么办 谢谢！
  
  ==========================================================================================================
  
  看蛋白是否降解，个人认为和你纯化后的目的条带相比，是否只有目的条带下面有杂带还是上面也有，如果只有下面有杂带，那估计是降解，如果上面也有杂带，则不好说；当然，防止蛋白降解是蛋白纯化的关键；
  防止蛋白降解有好几个要素：
  首先，在你设计克隆实验时就要考虑把亲和标签放在C端（如果放在C端不影响你目的蛋白的活性的话），这样在亲和纯化时就可以把那些在表达过程中已经降解的片段去除。
  其次，有条件的话，可以用cocktail抑制剂，没有的话加点PMSF；
  纯化的时间要快，温度要低；
  就透析，个人觉得晚上透析，过个夜就可以了；如果你蛋白这点时间都坚持不住的话；那你可以过G15，十分钟就完成。
  祝好运！

• fox_79 (2013-8-31 11:09:25)

  QUOTE:

  原帖由 gogo 于 2013-8-31 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我在做原核表达时，加了组氨酸标签，然后用镍柱纯化，纯化出来的蛋白跑电泳条带很好，纯度很高，但是用PBS透析掉咪唑，再用聚乙二醇浓缩后，然后再去跑电泳，条带变杂了很多，我怀疑是蛋白降解了，请问各位高手 怎么办 谢谢！
  
  =========== ...

  谢谢你的宝贵意见，另外我想请教下，要是之后目的条带上面有杂带，这应该怎么理解