【求助】请大家帮忙看一下我跑的电泳图

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• am10 (2013-9-04 16:14:59)

  
  1.蛋白定量有误，感觉没有1mg的上样量，楼主是用什么方法进行蛋白定量的？在跑双向之前可以先跑一块SDS胶，看蛋白提取是否成功顺便可以检测定量是否正确，如果连SDS胶都不理想，那就暂时先别做双向
  
  2.楼主可否提供裂解液的详细信息
  
  3.等电聚焦时样品是否有损失？一向跑完后，胶槽中是否有晶状物析出？有的话说明蛋白质在等电点附近沉淀出来，没有进入胶条，原因可能是IPG buffer或者水化液中的tris的问题。其次，转向后将IPG胶条保留，染色的时候顺便也染一下，这样可以检测一向聚焦是否成功。
  
  总的来说，感觉楼主是在提细菌总蛋白那步出现了问题，不知楼主是否能给出样品处理的一些详细信息，这样有助于分析问题

• guagua (2013-9-04 16:15:19)

  
  感觉你的聚焦程序设置的有点奇怪 最好重新改改 蛋白上样是1mg？觉得不够吧

• langlang (2013-9-04 16:15:58)

  
  胶条长度是多少？

• misswu61 (2013-9-04 16:17:50)

  QUOTE:

  原帖由 guagua 于 2013-9-4 16:15 发表
  
  感觉你的聚焦程序设置的有点奇怪 最好重新改改 蛋白上样是1mg？觉得不够吧

  是考染的，量不够吗？我的浓度是12ug/ul，所以加的时候只加了90ul，共1080ug。水化液添加了260ul，如果加太多蛋白上清液，水化液的量就相对少了。请问是不是我蛋白的浓度还需要再增大？
  
  请问聚焦的程序应该怎么改动一下合适呢？我查的国外文献都是用PH4-7的胶条，但最高电压也就5000V，或者只有写总聚焦的伏小时数，没见明确写达到8000V的。。很迷茫，不知道该怎样设计一向的条件...

• misswu61 (2013-9-04 16:21:28)

  QUOTE:

  原帖由 langlang 于 2013-9-4 16:15 发表
  
  胶条长度是多少？

  是18cm的。

• jkobn (2013-9-04 16:21:48)

  
  18cm的话，你可以参照biorad或者GE的操作手册，聚焦程序大概就是低压除盐、升压、聚焦、保持，你1000到5000最好是直接的 中间不要设置2500 和3500了，你是什么公司的仪器？最高电压一般都是8000吧

• jkobn (2013-9-04 16:23:30)

  蛋白上样1mg是可以的，不过不知道你的蛋白定量准不准确了

• misswu61 (2013-9-04 16:23:57)

  QUOTE:

  原帖由 jkobn 于 2013-9-4 16:21 发表
  
  18cm的话，你可以参照biorad或者GE的操作手册，聚焦程序大概就是低压除盐、升压、聚焦、保持，你1000到5000最好是直接的 中间不要设置2500 和3500了，你是什么公司的仪器？最高电压一般都是8000吧 ...

  哦。手册上面的会不会很大众化，各个样本需要各种不同的方法？当时怕电压上不去，就参考的国外文献上的条件，所以会有2500,3500V。下次我调整一下试试。
  
  还有就是仪器上的step-no-hold和gradient两种升压模式有什么不同的用法？跟样品有关吗？
  
  谢谢了！

• okhaha (2013-9-04 16:24:33)

  
  我想说几点:
  1. 样品好，用什么程序关键不大.GE上的程序基本可以满足一般要求，或者说，基本可以跑出较好的图你的结。如果你的电泳操作，尤其是转移胶条没有问题，那问题一般出在样品上。
  
  2.不同定量方法给出的结果差别很大。个人感觉用GE的2D定量KIT定出的5mg/ml的样品，电泳结果比较好。你的12 mg/ml也许太浓了，容易沉淀出来，形成胶上的条纹。
  
  3。二向的条件13w还要9小时，确实很慢。当然这和你用的仪器有关系。但是二向仪器上下槽相通了就不正常了。它们是隔离的以保证电流通过胶。但是感觉这点不是你图不好的原因。
  
  4。Tirs的PH8.8,用PH试纸调太粗放了。它对图的影响挺大。为了好的重复性，最好用ph计调，而且最好不要保存过久（我是现配现用）。

• misswu61 (2013-9-04 16:32:32)

  QUOTE:

  原帖由 okhaha 于 2013-9-4 16:24 发表
  
  我想说几点:
  1. 样品好，用什么程序关键不大.GE上的程序基本可以满足一般要求，或者说，基本可以跑出较好的图你的结。如果你的电泳操作，尤其是转移胶条没有问题，那问题一般出在样品上。
  
  2.不同定量方法给出的结果差别很大 ...

  非常感谢这位高手的指教！！
  
  1.你指出的这几条问题应该都存在，我认为样品的确没有经过很好的处理，对菌细胞超声破碎后没经过沉淀，里面肯定含有很多杂质，脂类，核酸等，更没有用试剂盒。老板让我这样做看能不能出结果（可能也为了节约经费吧）...定量是用的RC DC。
  
  2.另外有一点不懂，蛋白浓度高我加的蛋白量就少，水化液就多，有什么不妥吗？望指教。
  
  我当时考虑，如果蛋白浓度低，蛋白溶液的量就相对高，它和水化液混合后共350ul上样的，这样水化液不就少了么？如果水化液少了，各种成分（DTT，CHAPS,IPG buffer等）在混合后溶液中的浓度就相对高了。就怕一向电压上不去或者出现条纹。。。
  
  举例：如果定在5mg/ml，是否是将200ul蛋白溶液混合于150ul水化液中？水化液会不会太少了？这样混合之后，各离子浓度会不会有偏高的问题？
  
  还是说：你指的浓度是蛋白沉淀经水化液溶解后的上样终浓度？12mg/ml是我提出的纯蛋白浓度。。
  啰嗦了一堆，不知道是否表达清楚了。。
  
  3.仪器上下槽相通，我想知道可能会使我的结果有什么异常...只是时间延长么？...
  
  4.Tris我用采用你的提议，我也觉得ph试纸太不精确了。感谢！

• 66小飞侠 (2013-9-04 16:32:57)

  看来楼主已经找到问题结症所在：样品没有经过很好的处理，杂质太多
  另附一点自己的看法：
  1.如果样品溶液中含有尿素，RC-DC法测量的蛋白值会偏大
  2.样品浓度高在一向时会有沉淀析出，这个是实验经验，个人的理解是：在高浓度情况下蛋白质并非以溶解的形式存在于裂解液当中（特别是含有较多的疏水性残基），而是以蛋白多聚体以悬浮的形式存在于溶液中，就算加水化液稀释也不能使多聚体复溶。（此处为个人弱见，还望高手指点）
  3.二向16小时的样品也跑过（阿玛西亚24cm，6胶系统）图还不错。

• 00无名指00 (2013-9-04 16:33:38)

  
  我做过一些细菌方面的双向电泳，刚开始做的时候也想楼主那样，点不多，所以我想说一下我的看法。（我用的也是GE的等电聚焦系统和垂直电泳系统）
  1：样品的制备是非常关键的，我不知道你用的裂解液的成分是什么，我用的是7M尿素，2M硫脲4%CHAPS的裂解液，我觉得就够了。
  2：蛋白定量一定要准，我觉得GE的quant kit还可以，当然也有别人说不准，我用的还可以，操作一定要注意，每次都要做标准曲线，而且标准曲线的要达到0/95以上才能用。
  3：如果英文文献上大多用4-7的胶条，我建议你还是采用4-7的吧，我觉得一般的都是4-7 的分离效果要好一些，除非你做的特殊蛋白。
  4：我觉得你的问题肯定出在样品制备上面，如果你认为之类或者糖等含量很高的话，可以用超速离心的方法除杂，再用TCA-丙酮法沉淀，除去盐离子。（TCA-丙酮法不是必须的，而且沉淀以后再溶解比较难，所以我推荐如果超速离心以后效果可以的话就不要用TCA-丙酮法）。样品用裂解液裂解以后可以用超声的方法助溶，还可以添加核酸酶和蛋白酶抑制剂。
  5：我用过13cm的胶条，当时我的最高电压可以达到7000V，总的VH为4.5k。我觉得18cm胶条的最高电压可以高一点。等电聚焦程序，我觉得低电压的部分还可以，1000以上的时候，2500那一步不太必要，可以再1000与你的最高电压之间选一个电压设一下就可以。
  6：step-no-hold是一步升压，电压上升快，gradient是梯度升压，电压上升慢。小于1000v电压一般是用来除盐离子的，最好用gradient。我的所有程序都是用的gradient，当然除了30V那一步。
  7：平衡的时间不是越长越好的，不要超过30min吧，我都是用的15min。
  不同的样品使用不同的方法，你在摸索一下吧，好运啊！

• xiaoxiaoniao (2013-9-04 16:34:01)

  1 电压上不去
  样品处理很关键，没有好的样品一项不会跑好，也就不要分析一项以后步骤原因。
  用TCA/丙酮沉淀除掉样品中杂质和离子，也利于下一步蛋白定量。
  
  2 一向等电聚焦仪的电极板上面能看到很多水珠，正负极都有
  夏天室温很高，一项聚焦仪板上有控温装置；室温太高就会在上面出现冷凝水，估计保护装置会自动断电，一项当然不会跑好。
  房间空调温度控制20度。

• wood533 (2013-9-04 16:34:31)

  QUOTE:

  原帖由 00无名指00 于 2013-9-4 16:33 发表
  
  我做过一些细菌方面的双向电泳，刚开始做的时候也想楼主那样，点不多，所以我想说一下我的看法。（我用的也是GE的等电聚焦系统和垂直电泳系统）
  1：样品的制备是非常关键的，我不知道你用的裂解液的成分是什么，我用的是7M尿素，2M硫 ...

  非常感谢这位朋友的指导！能否再请教你几点...
  
  1.我今天遇到一个做过双向的博士师姐，她也怀疑我的样品制备有问题。我想请问你的样品是不是制备了之后立马进行蛋白定量和等电聚焦？我超声破碎了细菌之后，放在-20°一周之内在用。这个温度是不是太高，会使蛋白降解掉很多？我的裂解液成分是7M脲，2M硫脲，4%CHAPS，64mMDTT，5mMPMSF，2%IPG buffer（确实有点复杂...）
  
  2.弱弱的问一句，超速离心要求多少转速啊？需要多长时间？
  ① 我在细菌超声裂解之后立即12000g离心，4°条件下15min，收集蛋白上清液。不知是不是这一步需要超速离心去脂类和糖类等杂质啊？
  
  ②“样品用裂解液裂解以后可以用超声的方法助溶”这点不太明白...
  
  ③你讲的加入核酸酶和PMSF是不是裂解之后加进去的，再离心收集蛋白上清啊？
  
  再次谢谢你给的其他意见，我会参照修改的。

• wood533 (2013-9-04 16:35:56)

  QUOTE:

  原帖由 xiaoxiaoniao 于 2013-9-4 16:34 发表
  1 电压上不去
  样品处理很关键，没有好的样品一项不会跑好，也就不要分析一项以后步骤原因。
  用TCA/丙酮沉淀除掉样品中杂质和离子，也利于下一步蛋白定量。
  
  2 一向等电聚焦仪的电极板上面能看到很多水珠，正负极都有
  夏天室 ...

  嗯。就是。今天工程师来看了，说是因为室温太高，已经搬进有空调的房间了。
  
  谢谢！我已经做了蛋白沉淀，但是参照老板给我提的意见，只用了丙酮，没有用TCA，说怕有TCA残留，影响结果。我正在做，还不知道这样是否行得通...前辈知道这样可行么？

• wood533 (2013-9-04 16:36:16)

  QUOTE:

  原帖由 66小飞侠 于 2013-9-4 16:32 发表
  看来楼主已经找到问题结症所在：样品没有经过很好的处理，杂质太多
  另附一点自己的看法：
  1.如果样品溶液中含有尿素，RC-DC法测量的蛋白值会偏大
  2.样品浓度高在一向时会有沉淀析出，这个是实验经验，个人的理解是：在高浓度情况下 ...

  
  我之前一直以为浓度越大越好...
  前辈认为浓度多少算合适啊？

• 66小飞侠 (2013-9-04 16:36:54)

  
  1.根据实验室前辈们的经验，蛋白浓度一般在4ug-8ug/uL之间，浓度稀了就冻干浓缩，浓了加裂解液稀释。
  2.“样品用裂解液裂解以后可以用超声的方法助溶”----低功率超声可以帮助破膜、解离部分蛋白多聚体，并将溶液中的长核酸链打断，达到助溶和除核酸的效果。
  3.核酸酶和PMSF是在加裂解液的时候同时加进去的，溶解后的pmsf半衰期较短，要是怕样品因较长时间保存而降解，你可以用cocktail代替pmsf，另，离心后表面一层也可去掉，脂质多聚于上清表面。
  4.关于丙酮沉淀的问题，可以参看版内
  http://www.dxy.cn/bbs/thread/1180332
  etc
  祝楼主实验顺利

• misswu61 (2013-9-04 16:37:47)

  离心后最上层的脂质该怎么除掉，用移液枪吸走吗？
  
  谢谢！

• misswu61 (2013-9-04 16:40:20)

  
  直接用移液器吸就可以了

• zsxan1990 (2013-9-04 16:43:16)

  
  我的蛋白样品是制备以后试问放置3个小时定量，直接使用的，如果不直接使用的话就动在负八十冰箱，但是再次拿出来以后就不能再用了，所以建立分装好以后再冻起来。
  12000g只能出去不溶的物质，如果是脂类、糖之类的杂质的话，姚100000g，当时我用的超速离心机是30000rpm，四度离心一个小时。但是超速离心是有蛋白损失的，我的样品因为成分太复杂，总是做不好才超速离心的，结果确实好了一下。
  样品用裂解液裂解以后可以用超声的方法助溶是指样品用裂解液重重悬以后就去超声，因为超声有助于菌体裂解，拿去超声的液体里加核酸酶和蛋白酶抑制剂。