【求助】 关于上样量

最新回复

• yonger (2013-9-04 17:18:14)

  QUOTE:

  原帖由 079777chao 于 2013-9-4 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我正在学习western，请问各位高手，在做组织蛋白western时，用的梳子是多大的啊？宽的和窄的对跑出来的条带弥散有差别吗？还有上样量的选择，若目的条带表达弱，该怎么权衡弥散和上样量的关系啊？？我用的是1mm的10个道宽梳子，上样20ul ...

  梳子的大小取决你的上样量；宽的和窄的一样，不用考虑弥散程度，只要保证上样量一致就行；保证每个孔道上样的手法一样；弥散的程度和很多因素有关，不一定是梳子的关系。

• 079777chao (2013-9-04 17:18:54)

  
  终于有人回应了。谢谢啊，太感谢了。我上样量组织和细胞都一样，两个浓度也差不多，但是就是组织的连一起，细胞的就比较整齐。都是我自己操作的，手法是一样的，麻烦高手还有什么可以考虑呢，其他可以改进的地方能提点建议吗？是无助啊。。各位高手谢谢了。。

• IAM007 (2013-9-04 17:19:36)

  
  一般，Bio-rad的梳子，1.5mm的15道的上样量《50ul，10道的《30ul。上样量大了，样本就会溢出来。

• 079777chao (2013-9-04 17:19:54)

  
  谢谢啊。不过我不是上样溢出来，是我上完样跑完电泳后，在最后结果曝光时看见整个组织的条带连成一条线。用那种梳子都这样子，如果上样量太少，我上了5ul,我的目的蛋白表达很少，就没有条带出现，怎么办啊？？？我都急死了。。。各位高人指点指点吧。跪谢

• yueban-1147 (2013-9-04 17:20:18)

  
  上样量浓度太高了，减到15ul，或者稀释一下。

• yueban-1147 (2013-9-04 17:21:04)

  目的条带弱 ，可以提高一抗浓度， 还有就是延长曝光时间。

• nut6694 (2013-9-04 17:21:25)

  
  弥散可以考虑你胶的浓度不均一，还有电泳液PH值！条带不明亮可以加大一抗的浓度

• 079777chao (2013-9-04 17:21:49)

  
  谢谢啊。我试着提高一抗浓度了，我的抗体是多克隆，浓度太高我的非特异性条带比目的条带还亮，苦恼啊。。还想问问大家有没有什么好的经验，我的目的条带在曝光后，在我的marker指示的需要位置附近有好几条带，我不能确定那个是我的条带，有什么好的方法明确我的条带呢？

• 079777chao (2013-9-04 17:22:09)

  
  还有很奇怪的现象，我同时做两板胶，同样的电泳体系。一板细胞的样，一板是组织的样，组织的样就是弥散连成一条线，细胞的就好好的。昨天把上样量减低到8ul，内参是不连在一起了，可以看清轮廓，可是目的条带很弱，而且杂带很多，我分不清那个是我要的。怎么办啊，大家帮帮啊。。。。谢谢大家