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【求助】酵母表达纯化多肽
将小肽基因转到酵母中表达，需要将其纯化出来，这个小肽的原始文献（天然诱导提取）中用的缓冲液是pH是7.0，可是这个小肽的pI是10.9，理论上不是应该用小于pI 0.5个单位左右的缓冲液吗？？之前的实验我选择用9.9的碳酸盐缓冲液，纯化不出来啊。【求助】酵母表达纯化多肽
之前的实验：SP FF 强阳离子交换柱，2M盐线性梯度洗脱，大概1.2M Nacl洗脱下来一个大峰，之前还有若干小峰。电泳显示在目的处7kDa有条带，但是得增大灰度才能看出来，量是极小极小的，而且在3kDa处也有一条带，后来用凝胶柱 Superdex 30，脱盐加分离，奇怪的是，盐峰先于蛋白峰出柱，后来跑电泳更没有条带了，纠结呀纠结...
请做过酵母系统表达纯化的高手解答啊？大家给我支支招吧，谢谢
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【求助】酵母表达纯化多肽
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最新回复
feima+ (2013-9-04 17:25:33)
这是电泳图
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feima+ (2013-9-04 17:25:58)
SP FF 洗脱图
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6327555 (2013-9-04 17:26:24)
条件不明：
1、表达方式：分泌上清表达或酵母胞内表达？
2、样品体系：是否做过超滤、透析之类的换液操作？
3、柱平衡缓冲液的详细值？
4、是否确定有表达：做过活性测定或WB、Elisa等检测吗？
5、SP柱大小、上样量？
其它：
1、小肽的pI是10.9，理论上不是应该用小于pI 0.5个单位左右的缓冲液吗？？之前的实验我选择用9.9的碳酸盐缓冲液，纯化不出来啊。
理论是指要小于pI 0.5个单位以上，而不是左右。
pH9.9的缓冲液做SP柱吸附非常不合适，即使目标蛋白的pI为10.9。
建议选用pH7-8之间的缓冲液试试看。
2、大概1.2M Nacl洗脱下来一个大峰
这个1.2M是怎么得到的？出峰时的电导值是多少？
我觉得这儿应该有误。
一般蛋白质吸附到离子交换柱上，0.5-0.8M的NaCl就可以差不多洗脱完全了，剩下的是非蛋白类的核酸等强吸附物质。
3、后来用凝胶柱 Superdex 30，脱盐加分离，奇怪的是，盐峰先于蛋白峰出柱
盐峰不会先于蛋白峰出柱。盐峰后的峰不是蛋白，可能是小分子的酵母色素物质。
建议：
1、确定有目标蛋白表达
2、如果是上清表达，建议浓缩上清后SDS-PAGE，在电泳胶上要能看到目标条带才好进行纯化工艺的优化操作。
3、蛋白版欢迎提问，也有很多热心的战友。但是最好将纯化的各种条件在帖子中讲清楚，这样才能更快地得到帮助。建议看看帖子下方我的签名档“关于如何提蛋白质纯化问题”。
feima+ (2013-9-04 17:26:57)
QUOTE:
谢谢斑竹的解答表达方式是分泌表达，这个多肽是抗菌肽，分子量是7kDa，我一直用抑菌圈实验来确定里面活性物质的存在，在得到发酵液以后冻干之后更换的缓冲液，柱平衡缓冲液是10mM的碳酸盐缓冲液，pH 9.9,SP柱的柱体积是50ml，是个小柱子，每次手动上样，大概5ml。用2M NaCl洗脱，用电导率换算成大概1.2M 左右。还有出峰时的电导挺高，大概60左右。
CM Cellrose，之前也用过，用的也是pH 9.9的碳酸盐缓冲液，出峰后电泳也未跑出条带，斑竹的建议是继续用SP纯化呢，还是换CM? 然后缓冲液更换成7-8之间？
再次感谢
6327555 (2013-9-04 17:27:24)
冻干怎么更换缓冲液？是冻干后溶解再透析？
SP或CM都可以，若是两样都有，建议用SP。
样品也要换液的。
建议pH7.0，20mM PB先试一次SP。
feima+ (2013-9-04 17:29:17)
QUOTE:
发酵液冻干以后，用缓冲液溶解，然后过滤后之间上柱，不知可行否？嗯哪，我先换一次缓冲液试试，看看怎么样吧，谢谢您啦
feima+ (2013-9-04 17:36:19)
版主好啊，恩 用pH7.0的缓冲液又试了一下，电泳显示，目的条带在穿透峰里，没挂上柱。想了一下，是不是由于我之前将发酵液冻干，使上样的冻干液电导过高没挂上柱？一般要求能挂上柱的电导是多少呢？谢谢~
9900 (2013-9-04 17:36:49)
多大电导挂柱没有确定值，但是在吸附条件没有摸索建立之前，建议样品和平衡缓冲液的电导值小于3-4ms/cm。
看你的图应该用的纯化仪器不错的，应该有在线电导监测啊。
feima+ (2013-9-04 17:37:22)
1：将上次的穿透峰又重新SP分离，结果是用2M 盐洗，出现峰，但是电泳检测依然未挂住，还是在穿透峰里
2：把发酵液上清用平衡缓冲液调pH7.0,然后测电导约为3.0，又跑了一次，结果今天电泳检测依然没有挂柱，真是奇怪！
纠结死了~现在想我的多肽的pI大概10左右，是不是我用pH7.0的缓冲液，使杂蛋白太多了，造成了位点竞争，我的目标蛋白结合不上柱子啊？ 请各位帮忙分析分析，谢了
9900 (2013-9-04 17:37:43)
继续降低pH值，做SP。
我做过pI9.7的小蛋白，用pH6.0左右的条件才可以挂柱。
另外，小肽也可以尝试一下反相柱纯化，有时候效果特别好。
feima+ (2013-9-04 17:38:50)
反相,老板不想让用，说要是应用起来成本太高......
那我调低pH再试试，神奇的多肽~
谢谢版主了
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