【求助】磷酸化WB做不出来,请教各位战友!

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-10-06 14:54 作者: uuooii 来源: 分析测试百科网

小弟现在做磷酸化蛋白的WB,做了好几次都不出结果,操作步骤附下,请各位高手帮忙指点,不胜感谢..
裂解液为购买RIPA组织细胞裂解液(说明书中说含SDS,NP-40,去氧胆酸钠,偏矾酸钠,EDTA,PBS), 我自己配置了100ⅹ Na3VO4(正矾酸钠) (0.91克Na3VO4溶入50ml ddH2O中)
1. 取约100毫克组织放入预冷研钵中,一边加入液氮一边研磨,待组织成粉末状后加入1mlRIPA和10ulPMSF 以及10ul正矾酸钠,震荡混匀,冰上静止30分钟.
2, 4度离心15000转离心30分钟,取上清液,-80度保存.
3,上样前5ⅹloading buffer和蛋白1:4混合,煮沸10分钟,适度离心.每孔上样30ul,电泳,并转膜.可见预染marker蛋白条带转到pvdf膜上了.
4封闭用的是BSA,室温2小时,
一抗使用的是CST的,比例1:500,4度冰箱14小时以上.二抗中衫的,1:600室温两小时.ECL显色...
想请大家帮忙看看操作步骤有无问题,主要是蛋白提取的步骤,是不是加的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂种类不够,如果是的话请能够详细指点指点具体的量和配法. 还有就是蛋白提出后是直接放-80度冰箱好呢还是加上一定比例的buffer并煮沸后放-80好些,是不是后一种操作对保持磷酸化更好些呢? 我在煮沸离心后发现虽然整个EP管都是兰色的,但还是有相对的分层,上面要清澈些,下面感觉有些沉淀,那我在上样时是一起吸上去呢还是只要上清???
很多问题请教,请各位高手帮帮忙,做不出来心急啊!!!!
万分感谢!!!

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PINK (2013-10-06 14:55:15)

1.考虑裂解液的问题，虽然你的裂解液里已含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，但是含量可能有些低，建议可再加入1mM/L的NaF（磷酸酶抑制剂）及1mg/L的Leupetin和Pepstatin A（蛋白酶抑制剂）试试；
2.研磨的时候要保证低温迅速，不然很容易去磷酸化的；
3.总蛋白浓度测过没有，30ul有多少蛋白啊，组织提的蛋白上样量要大些，我们一般用 60~100μg（与目的蛋白的含量有关系）；
4.封闭的话个人觉得单抗1小时，多抗1.5小时足够了；
5.一抗的浓度是否低呢，最好做个梯度摸摸，二抗也最好做个梯度；
6.另外最好同时做内参，看看你的蛋白或转膜，显影等有没有问题；
蛋白提取分装后直接放-80就行，煮沸离心后是吸上清；
WB是个比较繁琐的过程，每一步都要注意，以上意见供你参考，希望顺利！
uuooii (2013-10-06 14:55:44)

请问1mM/LNaF,1mg/L Leupetin和Pepstatin A所加体积是多少呢?
PINK (2013-10-06 14:56:16)

QUOTE:
原帖由 uuooii 于 2013-10-6 14:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

请问1mM/LNaF,1mg/L Leupetin和Pepstatin A所加体积是多少呢?
按你加入组织的裂解液的体积计算啊，另外你可看看你的一抗说明书，要不要求上样前煮沸，可能这也是一个影响因素。
uuooii (2013-10-06 14:56:48)

我又看了遍说明书,上样前需要煮沸5分钟.今天晚上去图书馆查资料,又想到一个问题(不知道算不算问题,上样之前煮沸,蛋白会变性,物理性质变化,溶解度下降.那么离心后只取上清液而不要下面的沉淀会不会漏掉一些蛋白呢?
还就是煮沸变性后的蛋白会不会又复性呢? 如果不会复性的话那么一抗怎么结合抗原呢?(煮沸后蛋白的结构会发生变化啊") 问的问题太多了,请见谅!
PINK (2013-10-06 15:01:42)

QUOTE:
原帖由 uuooii 于 2013-10-6 14:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我又看了遍说明书,上样前需要煮沸5分钟.今天晚上去图书馆查资料,又想到一个问题(不知道算不算问题,上样之前煮沸,蛋白会变性,物理性质变化,溶解度下降.那么离心后只取上清液而不要下面的沉淀会不会漏掉一些蛋白呢?
...
首先，样品在加了上样buffer后煮沸蛋白是不会沉淀的，因为上样buffei里的sds会结合蛋白，使蛋白带上负电荷，而buffer的ph值为6.8 ，在这样的环境下蛋白是不会沉淀的，我们知道蛋白质只有在它的等电点（净电荷为0）是才沉淀（排除化学因素），沉淀的是一些别的杂质；另外，上样buffer中含有DTT或二巯基乙醇等还原剂的话，变性后的蛋白是不会复性的；变性的目的就是为了暴露与一抗结合的蛋白的表位。
uuooii (2013-10-06 15:02:01)

今天下午去化工公司买了氟化钠和焦磷酸钠,上网查了Leupetin和Pepstatin A,是sigma的,价格太贵了.这两个东西是不是必须要呢?
还有就是在上样的buffer和电转液里面还加不加磷酸酶抑制剂呢?如果变性的蛋白是不可逆的,那么理论上磷酸酶已经没有活性了啊,那就可以不用加吧,但是我看<<分子克隆实验指南>>上说在电转时还要加矾酸钠(我上次做的时候也加过一次.也没有出结果),请问在具体操作上是怎么样的呢?
PINK (2013-10-06 15:02:22)

在上样的buffer和电转液里不用加磷酸酶抑制剂，Leupetin和Pepstatin A最好加上，你可以联系代理买进口分装的，用量很小。
taoshengyijiu (2013-10-06 15:03:45)

先找个阳性对照,抗体本身的原因可能性也很大,磷酸化抗体本来就不大好做,然后再从自身找原因,比如目的蛋白丰度,样品处理,磷酸酶抑制剂等