【求助】可溶性蛋白的表达和处理，急呀！谢谢

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• wmp1234 (2013-10-09 16:47:25)

  
  你好，对于原核表达目的蛋白以可溶形式表达，的确对下游工作很有益处，
  主要有以下几点：
  1 较好的保持目的蛋白的活性；
  2 节约了时间，如果以包涵体形式表达，需要经过包涵体洗涤、溶解变性、变性蛋白的复性，这些是多余出来的步骤，所以表达在上清中可以简化你的操作过程，同时也会减少蛋白的损失，你在包涵体处理以及变复性过程蛋白质会损失的；
  对于你提出的问题，我有几点建议：
  1 通过表达条件的优化选择，看能否提高目的蛋白的表达量；主要考虑温度、IPTG、接种量等因素；
  2 若大量制备，需要很多菌的问题，如果有条件的话，可通过发酵，这样应该可以得到你所需要的量；
  3 既然你选择了HIS-tag 标签，用镍柱初步纯化是比较好的选择，其实镍柱处理及操作过程也不是很麻烦；
  4 如果你要浓缩，我不知道你的单链抗体能不能够用硫酸胺沉淀，如果对你的蛋白质不影响，硫酸胺沉淀在一般的实验室都能做得到，沉淀后经透析、离心，在进行下一步的分离纯化操作。
  祝你实验顺利

• 6327555 (2013-10-09 16:47:45)

  用镍柱初步纯化主要问题是上清量太大，可以直接上样1000 毫升吗？
  
  由于单链抗体不是完整的免疫球蛋白，硫酸胺沉淀？？
  
  发酵我实验室还未做过，怎样操作，有简化方法吗？？
  
  再次感谢，不吝赐教！

• summerxx (2013-10-09 16:48:08)

  
  上清量和菌液的量没有什么关系啊，如果你的表达量很小，那离菌后就用较少的结合缓冲液重悬嘛，不过融菌酶到是可以多加点。

• ritou1985 (2013-10-09 16:48:31)

  
  对于你所说的主要问题是上清量太大，其实1000 毫升根本不算体积很大，我原来做过的上样3升，这主要看你的样品中目的蛋白质的含量是否超过镍柱的负载能力，你所做的大概步骤可以如下：依你所说的摇瓶，
  1 你可以每次摇瓶表达4升，离心收集菌体；如果有时间的话，可以有高水或缓冲液洗涤一下菌体；
  2 破菌，不知道你选择什么方式破菌，你可以用400-500ml缓冲液悬浮沉淀，混匀后破菌；
  3 收集上清：离心弃去沉淀，在你的目的蛋白以可溶状态表达时；
  4 将收集的上清可直接上样于镍离子螯合柱，这样不可能出现像你所说的会有1000ml样品；
  5 后面的纯化步骤就要你多多考虑如何选择你的层析柱。

• greenbee (2013-10-09 16:48:52)

  
  1、不知楼主所说的可溶性蛋白是在培养基中还是在裂解细菌的上清中，如果是前者可考虑greenfield 战友的方法；若是后者一般规定1克湿菌仅加5 ml裂解液，最后的上清量并不是太大！
  2、你目前的关键的是要提高表达效率，除了注意培养温度、诱导剂浓度，还要注意加诱导剂前一定要把细菌摇足量，因为含表达质粒的细菌量不够的话，目的蛋白的表达量自然也很低的，不确定时可测一下菌液的OD值再加诱导剂；
  3、镍柱纯化HIS-tag标签蛋白其实较难得到单一的产物，特别要注意调整Bind/wash/elution buffer的盐浓度、PH值、咪唑浓度，可搜索相关的帖子，本版讨论很多。
  祝你成功！

• 6327555 (2013-10-09 16:49:44)

  
  可我的蛋白是原核表达可溶性的，在上清中！

• 6327555 (2013-10-09 16:50:35)

  在培养基中！谢谢指点

• fsdd817 (2013-10-09 16:51:18)

  
  看来你的蛋白是分泌表达（分泌表达和可溶性表达是不一样的，见此贴：
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/1331335')）。
  我想是否可以先用离子交换进行初步纯化并浓缩，离子交换并不受体积的影响，洗脱后收集目标蛋白再进行镍柱纯化，你看如何？不过实验室必须有纯化系统了。

• bring (2013-10-09 16:51:43)

  
  上样量体积太大，目的蛋白质浓度比较低的情况下，可以把镍柱料直接加到破菌上清中，慢慢摇动过夜，结合效率很好的。