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【讨论帖】大肠杆菌表达之四步曲
我个人认为大肠杆菌表达研究有四重境界 【讨论帖】大肠杆菌表达之四步曲
1）初次尝试扫盲篇
第一次接触原核表达系统，心理有些忐忑不安，仔细阅读载体使用手册，小心翼翼地构建质粒，转化，诱导，迫不及待地走完SDS-PAGE，染色、脱色，望眼欲穿地看着那些兰色的条带，经常遭到当头一棒。
2）乱棍打枣入门篇
开始总结一些规律，那就是尽可能收集各种不同特点和诱导方式的载体和各种特点的宿主菌。融合表达，非融合表达，温度诱导，IPTG诱导，Arabose诱导......这个阶段有时觉得自己很富有，手里有各种棍子，抡出时感觉经常很好，虽然结果不总是那么争气，但经常可以打落几颗枣子。
3）系统优化中级篇
开始研究自己手里的棍子和别人手里的棍子，开始制造工具（这是人类的特点）。密码子优化，mRNA5'UTR优化是经常考虑的因素。这个时期的特点还有经常发现别人的综述写得很好，自己手里的棍子打出去时开始带有目的性，但仍然喜欢乱棍战术。
4）自成一体高手篇
喜欢把载体看成一堆零件，有自己的表达系统和风格，根据基因的特点和研究目的使用合理的战术，抡棍子的次数减少，捡到的枣子渐多，用自己制造的工具从事创造性的劳动。
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最新回复
966735obeng (2013-10-10 16:44:05)
yes4 (2013-10-10 16:44:36)
UTR是指非翻译区，即5'段和3'段的不能翻译成蛋白质的区域（起始密码子之前5',终止密码子之后3'）。
S6044 (2013-10-10 16:45:02)
谢谢！！
lixi559 (2013-10-10 16:45:23)
nut6694 (2013-10-10 16:45:52)
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各位过奖了！谢谢！
mRNA5'UTR就是非编码区，不编码氨基酸的区域，主要在翻译水平调控基因表达，在真核和原核表达系统都很重要。对高等真核生物表达系统来说，5‘UTR长度，AT含量与翻译效率关系很大。对于大肠杆菌表达系统来说，一般避免其5‘UTR形成复杂的二级结构，尤其是SD序列被发夹结构所结合，SD序列与ATG之间的距离等因素也很重要。
nut6694 (2013-10-10 16:51:07)
你的对照（空载体）可以诱导出表达，说明诱导条件没有大问题。基因测序也没有发现问题。现在的问题可能有以下几个方面：
1）基因的遗传密码使用情况与大肠杆菌的偏爱性不一致，最好使用Codonplus宿主或对遗传密码进行适当优化
2）换一下其他载体有时有帮助，可以试一下，这也算乱棍打枣吧
3）你可以做一下Westernblot，看看你诱导出的条带是否是目的蛋白，因为SDS-PAGE的分子量与迁移率不象线性DNA agarose电泳那么精确，蛋白分子量有时会出现电泳表观分子量与理论分子量不一致的情况，有时会相差超过10Kd。
4）你的基因全长是否都是必须区，有没有可能把某些区域删除。拿抗原表达来说，某些区域疏水性强，对细菌有毒性，但免疫原性弱，所以可以删除这样的区域以降低表达难度。
抛砖引玉！
831226 (2013-10-10 16:51:31)
还有您提到的“使用Codonplus宿主或对遗传密码进行适当优化”是什么意思？能否解释详尽点？
linsa朋友，我们实验室也用过类似的载体。
你的对照（空载体）可以诱导出表达，说明诱导条件没有大问题。基因测序也没有发现问题。现在的问题可能有以下几个方面：
1）基因的遗传密码使用情况与大肠杆菌的偏爱性不一致，最好使用Codonplus宿主或对遗传密码进行适当优化
2）换一下其他载体有时有帮助，可以试一下，这也算乱棍打枣吧
3）你可以做一下Westernblot，看看你诱导出的条带是否是目的蛋白，因为SDS-PAGE的分子量与迁移率不象线性DNA agarose电泳那么精确，蛋白分子量有时会出现电泳表观分子量与理论分子量不一致的情况，有时会相差超过10Kd。
4）你的基因全长是否都是必须区，有没有可能把某些区域删除。拿抗原表达来说，某些区域疏水性强，对细菌有毒性，但免疫原性弱，所以可以删除这样的区域以降低表达难度。
抛砖引玉！
nut6694 (2013-10-10 16:51:57)
1)使用Codonplus宿主或对遗传密码进行适当优化
外源基因的遗传密码使用频率是影响基因表达的最重要因素之一，无论原核系统和真核系统都是如此。遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于频繁利用这些密码子中的一部分，对其他同义的密码则使用很少或几乎不用，最经常使用的密码被成为偏爱密码，几乎不使用的密码被称作稀有密码。这种现象称作遗传密码偏爱。同义密码于的使用频率与细胞内同源tRNA的相对数量有直接关联，遗传密码偏爱反映的是对应与某一种氨基酸的tRNA在细胞中的丰度的差别。从统计学意义上来说，遗传密码的偏爱性与基因表达水平有显著的相关：一种特定生物中，天然高表达基因往往比低表达基因更多地使用偏爱密码。
大肠杆菌是表达生产重组蛋白的最常用的工具，外源基因尤其是真核基因含有大量大肠杆菌稀有密码子，导致这些基因不能在大肠杆菌得到高效表达。大肠杆菌基因中使用频率最低的密码子是精氨酸密码子AGA／AGG。
大肠杆菌遗传密码偏爱性可以参照http://www.kazusa.or.jp/codon/
AGG arginine
AGA arginine
CGG arginine
CGA arginine
GGA glycine
AUA isoleucine
CUA leucine
CCC proline
外源基因中的稀有密码予是影响大肠杆菌表达的重要因素。稀有密码子尤其是串联稀有密码子能降低甚至耗竭胞内tRNA资源．降低蛋白表达水平．甚至引起外源mRNA翻译的提前终止和移码突变。
为提高外源基因转录产物的翻译效率，有必要对某些基因的遗传密码使用情况进行优化，使之更符合大肠杆菌的要求。通过点突变或基因全合成可以部分或全部消除遗传密码偏爱性对基因表达的不利影响。此外，使用携带额外的与稀有密码对应的tRNA基因拷贝的宿主菌也有助于消除稀有密码造成的翻译瓶颈。这类宿主菌的典型代表是BL21-CodonPlus ™-RIL series。Stratagene has created variants of the E. Coli ® BL21-Gold cells * called the BL21-CodonPlus ™-RIL series** of strains, which contain extra copies of the E. coli argU, ileY, and leuW tRNA genes. This modification allows for a high-level expression of proteins that are difficult to express in conventional E. coli hosts due to the codon bias of the gene of interest. The BL21-CodonPlus-RIL strains can eliminate the need to move the gene of interest into eukaryotic expression systems.
Co-expressing the genes encoding for a number of the rare codon tRNAs. There are several commercial E. coli strains available that encode for a number of the rare codon genes。 (www. Stratagene.com)
2）我现在也在表达某一段基因，是用于做抗体的，只知道其碱基序列，在表达之前想根据其氨基酸序列分析它的抗原性，及其蛋白质的三维结构，不知道能否推荐有类似功能的软件呢？
这个问题请查找我们论坛的帖子，eeflying等对这个问题有精辟的论述。例如：
http://www.jiansuo.net/cgi-bin/u ... mp;bpg=3&age=60
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