【求助】大分子蛋白提取中遇到的问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-10-11 11:15 作者: seagate 来源: 分析测试百科网

我最近要做Western Blot ，提取细胞中的蛋白进行转膜时，老是没有大分子蛋白，各种条件都摸了，膜上还是空白的。结果用考马斯亮蓝染了后发现我提取的蛋白中小分子蛋白含量还可以，大分子蛋白基本都没有，可是我的细胞本来应该大量含有这种大分子蛋白的，而且原来的师姐做出来过这种细胞中含有大量此种大分子蛋白。我怀疑是我的蛋白提取步骤中有问题。或者是凝胶的问题？各位高手有没有遇到同样问题的，是怎么解决的？或者有没有能指点我的问题在可能在哪儿的？不胜感激！

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【求助】大分子蛋白提取中遇到的问题

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最新回复

831226 (2013-10-11 11:15:50)

凝胶问题好解决，找其它人帮你跑个电泳，别忘了加蛋白marker。
蛋白提取方面你得把你的提取方法放上来，才能知道哪里有问题。
还有就是你提取出来的蛋白是总蛋白吗，那应该各个分子量都有，有一种可能是蛋白降解了，但是也不可能这么厉害啊。确保你的细胞没问题，提取的时候都放冰山，再加入蛋白酶抑制剂。
从你的情况来看是凝胶问题和转膜的问题可能性比较大一些。
u234 (2013-10-11 11:16:12)

同关注我一个大分子怎么做也做不出来
LZ能把你的分子量大小和电泳转膜条件说一下
yysr238 (2013-10-11 11:16:31)

考虑
1、转膜时间
2、转膜方式湿转还是半干
3、NC还是PVDF
DNA (2013-10-11 11:16:49)

我做的是210KD左右的蛋白，我用80伏、90、100伏都试过，发现内参爆出来很清晰，但是大分子染膜时不清晰，是不是电压太高把蛋白降解了，急死人了
gogo (2013-10-11 11:17:21)

依据楼主的描述，看来是蛋白提取有问题，你的蛋白是原核表达还是真核表达？真核表达是胞内表达还是胞外表达？
seagate (2013-10-11 11:17:46)

我的蛋白是原核表达，前阵子我已经找出问题的原因了，是因为电泳的问题，后来有一次跑的时间长了些，看到那条条带在最上面终于出现了。多谢各位的帮助了！
qiangren789 (2013-10-11 11:18:10)

请问一下，我的蛋白是280kda，也是做不出来，不知道是蛋白提取，电泳，转膜哪儿出错啦
电泳浓缩胶80V,分离胶120V。转膜300mA 3 .5小时，结果很不好。
seagate (2013-10-11 11:18:41)

QUOTE:
原帖由 qiangren789 于 2013-10-11 11:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
请问一下，我的蛋白是280kda，也是做不出来，不知道是蛋白提取，电泳，转膜哪儿出错啦
电泳浓缩胶80V,分离胶120V。转膜300mA 3 .5小时，结果很不好。
我的电泳条件跟你的差不多，你有没有跑完电泳用考马斯亮蓝染一下，看是不是有条带？如果没有就是电泳的问题。如果有条带，发光发不出来，可以将膜染个丽春红，看是不是没转过去或者转过了。这个条件每个实验室差异也很大，还是要靠你自己好好摸索一下了。
qiangren789 (2013-10-11 11:19:15)

QUOTE:
原帖由 seagate 于 2013-10-11 11:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我的电泳条件跟你的差不多，你有没有跑完电泳用考马斯亮蓝染一下，看是不是有条带？如果没有就是电泳的问题。如果有条带，发光发不出来，可以将膜染个丽春红，看是不是没转过去或者转过了。这个条件每个实验室差异也很大，还是要 ...
用丽春红染膜，小分子蛋白效果挺好的，大分子感觉有点弥散，或者说是成大块状分布、
大分子蛋白的电泳和转膜或者是提取需要注意什么啊？
师姐能不能提供你们做大分子的具体步骤啊，想参考一下，谢谢！谢谢！
seagate (2013-10-11 11:19:39)

这方面我还真没什么经验，我当时就是电泳时间短了，大分子没跑下来，后来延长了电泳时间就有条带了，电泳什么的条件跟你的一样，你的问题我也不知道怎么解决。