【求助】抗体在SDS-PAGE中结构和分子量会发生什么变化？

最新回复

• zsxan1990 (2013-10-11 16:52:41)

  
  高级构象应该被破坏。但各链之间有二硫键相连，变性剂不会破坏共价键吧（分子量应该不变吧）？能否实验试一下。

• H2O (2013-10-11 16:52:58)

  
  轻链和重链应该是分离的吧

• u76mp (2013-10-11 16:53:20)

  我前几天正好做了Ig G的非还原SDS-PAGE。在不使用还原剂的情况下轻链和重链是不分离的，我用的那几种Ig G分子量有150kD左右，是鼠单抗。在上样之前把蛋白质样品变性的过程中，蛋白质高级结构破坏。如果是使用足量的还原剂的话，轻链和重链是分离的，分子量应该分别是25kD左右、55kD左右吧。Ig M的我没有做过。

• bhka (2013-10-11 16:53:42)

  请问你的电泳条件是什么？电压和电泳时间？
  如果是IgM，我用180V电压，大概需要多长时间才能跑出来？

• 3N4G (2013-10-11 16:54:05)

  
  好问题，我顶！
  顺便请教各位前辈：
  是否所有的抗体不论单抗还是多抗，跑出来的SDS-PAGE条带是固定的，分轻链和重链两条带？不管是IgG,还是IgM，而且分子量大小近似，我是指种类之间的分子量。
  谢谢指教！

• u76mp (2013-10-11 16:54:31)

  
  我用的胶厚度为1.0mm；分离胶是10%，浓缩胶为5%；浓缩胶60V，45分钟左右，分离胶120V，一个小时左右（溴酚蓝的带离底部还有1cm）。如果你要做的话，我觉得用这种条件不大好。我的目的只是为了大体上了解我使用的这些购买的抗体产品中有些什么东西，实际上我只做过两次SDS-PAGE，是个新手。没有做什么条件的优化。分离胶的分辨范围是：15%——15-45kD，12.5%——15-60kD，10%——18-75kD，7.5%——30-120kD，5%——60-212kD；如果感兴趣的良种蛋白的分子量差异大，最好是用梯度胶。不过我看有用10%的胶进行非还原SDS-PAGE检测单克隆抗体的纯度的。跑IgM是什么情况我不清楚。
  如果是单抗，纯化得好的话，做非还原的就是很清晰的一条细带 ，还原剂足够就是轻链、重链两条清晰的细带，还原剂不足会是三条细带吧。多抗的话，针对各种不同表位的抗体分子量应该会有一定的差别。种类之间的分子量应该是有明显差别的。
  

• bhka (2013-10-11 16:54:51)

  IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链,分子量约为900000,如此大的分子量请问用多少浓度的分离胶为好呢？有资料说，1万～1百万可用7.5％，是否可靠？

• jkobn (2013-10-11 16:55:16)

  好问题，我顶！
  顺便请教各位前辈：
  是否所有的抗体不论单抗还是多抗，跑出来的SDS-PAGE条带是固定的，分轻链和重链两条带？不管是IgG,还是IgM，而且分子量大小近似，我是指种类之间的分子量。
  谢谢指教！
  
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  是的，重链区基本没有什么变化，轻链区会有点模糊，不同抗体的可变区大小不固定，会有差别。多抗里也有其它类抗体，IgM 等。

• u76mp (2013-10-11 16:55:39)

  
  在《蛋白质技术手册》中提到，使用3%-30%的梯度胶可以分离13-950kD的蛋白质。如果觉得不可靠的话，可以试试还原SDS-PAGE。

• idea2011 (2013-10-11 16:56:06)

  IgG和IgM分别会发生什么变化？
  
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  我做过IgG的SDS-PAGE，跑出两条带，一条分子量为50000左右，一条分子量在23500左右，符合IgG的轻链，重链的分子量数，且屡试不爽。这样就说明SDS可将其二硫键打断。

• jujuba (2013-10-11 16:56:34)

  我做过IgG的SDS-PAGE，跑出两条带，一条分子量为50000左右，一条分子量在23500左右，符合IgG的轻链，重链的分子量数，且屡试不爽。这样就说明SDS可将其二硫键打断。
  
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  纠正您一个概念。不是SDS 将二硫键打断，是上样缓冲液中的DTT。

• yonger (2013-10-11 16:56:55)

  
  我想问一下，我跑的在90多KD左右也有一个条带，而且比55KD左右的要亮很多，这是什么啊？我的抗体是自己设计的抗原，公司合成的抗体。谢谢